This protocol describes the labeling of epidermal growth factor receptor (EGFR) on COS7 fibroblast cells, and subsequent correlative light- and electron microscopy of whole cells in hydrated state. The label contained fluorescent quantum dots. The protocol can be used to study the stoichiometry of EGFR at the single molecule level.
Questo protocollo descrive l'etichettatura del fattore di crescita epidermico (EGFR) su cellule di fibroblasti COS7, e la successiva microscopia a fluorescenza correlativa e la scansione ambientale microscopia elettronica (ESEM) di cellule intere in stato idratato. Punti quantici fluorescenti (QDs) sono stati accoppiati EGFR mediante un protocollo di etichettatura due fasi, fornendo una proteina etichettatura efficiente e preciso, evitando etichetta indotta raggruppamento del recettore. Microscopia a fluorescenza ha fornito immagini panoramica delle posizioni cellulari del EGFR. Il rivelatore microscopia elettronica a trasmissione scansione (STEM) è stato utilizzato per rilevare le etichette QD con una risoluzione nanometrica. Le immagini risultanti forniscono dati di correlazione della distribuzione EGFR cellulare e la stechiometria a livello molecolare unica nel contesto naturale della cellula intatta idratato. Immagini ESEM-STEM ha rivelato il recettore di essere presente come monomero, come omodimero, e in piccoli gruppi. Etichettatura con due QDs differenti,cioè, uno che emette a 655 nm ea 800 rivelato risultati caratteristici simili.
Un nuovo approccio è stato introdotto di recente, di cellule intere di immagine con proteine marcate allo stato liquido utilizzando STEM 1-3, o microscopia a fluorescenza correlativa e STEM 4-7. Questa metodologia è in grado di studiare la distribuzione spaziale delle proteine di membrana e complessi proteici compresa la loro stechiometria a livello di singola molecola nelle membrane plasmatiche intatte cellule intere. Qui, descriviamo un protocollo che coinvolge un'etichettatura specifica in due fasi di proteine recettori con punti quantici (QD fluorescenti) 8, e microscopia ottica correlativa e ESEM-STEM. Come esempio, abbiamo studiato l'EGFR, una proteina di membrana che appartiene alla superfamiglia di proteine chinasi. In seguito al legame ligando, il recettore attiva e quindi forma un dimero con un'altra EGFR attivato; la successiva cascata di segnali guida la proliferazione delle cellule 9. Le mutazioni che portano alla espressione di EGFR anormale o attività svolgono un ruolo centrale in molti tipi di cancro 10. Studying la disposizione spaziale di questo recettore di membrana in cellule intere fornisce importanti informazioni contestuali sulla sua funzione ed eventuali modifiche della stessa 11-14. Ma resta difficile da sondare la distribuzione dei monomeri, dimeri EGFR, e cluster direttamente su una (sotto) livello cellulare con metodi di microscopia biochemical- o tradizionali 15. Il nostro metodo è in grado di visualizzare EGFRs con una risoluzione spaziale di alcuni nanometri tale che le posizioni di proteine in un complesso può essere determinato. Soprattutto, le informazioni ottenute sulla distribuzione stechiometrico riferisce alla situazione nativo della proteina nella cellula intatta.
Al fine di ottenere una breve distanza tra l'etichetta e il recettore, EGFR è stato marcato direttamente tramite il suo ligando EGF, utilizzando un legame biotina-streptavidina ad un QD. Questa etichetta può essere rilevato sia con la microscopia fluorescence- ed elettronica. Abbiamo usato questa etichetta per l'imaging correlativo cellule COS7 inliquido racchiuso in una camera di microfluidica precedenza 1,16,17. Tuttavia, a causa di un multiplo di streptavidina molecole per QD, tale etichetta può indurre il clustering recettore, portando ad una bassa efficienza di etichettatura o esperimenti piuttosto costose, e non è possibile concludere sulla stechiometria della proteina in esame. Etichetta indotta raggruppamento recettore può essere evitata del tutto impiegando la procedura di etichettatura due fasi qui presentato, causando una sonda biotinilata comprendente EGF per cui solo uno streptavidina-quantum dot (STR-QD) è accoppiato. Le cellule vengono incubate con EGF biotinilato, e poi fissate. Il passo fissaggio determina il punto di tempo in cui i processi di proteine vengono arrestati (a seconda della velocità di fissaggio). STR-QD viene applicato successivamente come secondo passo del protocollo di etichettatura. Clustering non avviene dal movimento della membrana dinamica delle proteine è ostacolata volta le proteine sono fissi. Inoltre, la soluzione STR-QD, che è ilpiù costoso componente dell'esperimento, può essere applicato in una bassa concentrazione ottimale, e questa seconda fase di etichettatura non è tempo cruciale, cioè, il QD può essere accoppiato in alcuni minuti.
Per studiare la stechiometria di EGFR come distribuito in cellule intere, campioni cellulari sono stati preparati su microchip di silicio 18. Dopo aver applicato l'etichettatura QD in due fasi, e la registrazione delle immagini microscopia a fluorescenza, le cellule sono state lavate con acqua pura, e ripreso in stato idratato utilizzando ESEM-STEM 19. Le immagini risultanti correlative forniscono informazioni sulla distribuzione EGFR cellulare e la stechiometria nel loro contesto naturale delle cellule idratate. Un metodo simile è stato utilizzato per studiare le proteine HER2 nelle cellule del cancro al seno in un recente studio 7.
Studiando la distribuzione spaziale e stechiometria delle proteine di membrana, quali l'EGFR, in cellule intere fornisce importanti informazioni contestuali sulla sua funzione ed eventuali modifiche thereof 11-14. Esso è impegnativo per studiare la distribuzione dei monomeri, dimeri e cluster direttamente a livello subcellulare mediante metodi biochimici comunemente usati, per cui la perdita di informazioni sulla localizzazione della proteina nella cellula o le differenze tra le cellule 15. L'etichettatura e microscopia metodi qui descritti permettono la visualizzazione di complessi proteici su una scala di lunghezza di pochi nanometri in modo che la sua stechiometria può essere studiato nell'ambito di singole cellule intatte 4-7. Questo non è possibile con (risoluzione super) microscopio ottico 23 in quanto la risoluzione non è sufficiente per distinguere molecole impegnati in un complesso proteico. Trasferimento Förster Resonance Energy (FRET) è una tecnica di media insieme <sup> 24, e non necessariamente rilevare i dimeri ei cluster di ordine superiore come conseguenza del corto raggio del trasferimento di energia 25. Prossimità saggi legatura 26 realtà non misurano distanze e non sono quindi in grado di distinguere tra una regione cellulare ad alta densità di proteine, portando inevitabilmente ad un certo numero di prossimità rilevato da casualità, da una regione cellulare con una densità simile proteine, ma contenenti proteine complessi espositrici distanze distinte tra le etichette. L'elevata risoluzione richiesta per visualizzare i costituenti di complessi proteici è ottenuta mediante microscopia elettronica a trasmissione (TEM). Tuttavia, TEM convenzionale di cellule intere è limitato dal requisito di campioni sottili / affettatura attraverso la membrana plasmatica 27, o plasma membrana strappo o rottura off 28,29 conseguente pezzetti costituita fortuitamente su membrana sezioni. La membrana plasmatica non è quindi ripreso nel suo insieme, portando ad una mancanzadi forse cruciale informazioni contesto cellulare.
Altre sfide sperimentali per lo studio di proteine stechiometria in cellule derivano da etichettatura proteine applicata. Comunemente immunomarcatura utilizzato sopporta la difficoltà che uno-a-uno stechiometria tra ricettore e l'etichetta può essere raggiunto solo con una sonda monovalente; questo non è il caso quando sono richiesti anticorpi primari e secondari. Per ottenere informazioni sulla stechiometria proteine, è necessario che la sonda si lega unicamente per un epitopo sul recettore ed ha un sito di legame per una sonda a fluorescenza o un alto numero atomico nanoparticella sull'altro lato. In secondo luogo, la precisione ottenibile con l'anticorpo etichettatura è limitata a causa delle loro grandi dimensioni 30 al 30 nm, in modo che una discriminazione tra vicini singole proteine, omodimeri o cluster di grandi dimensioni non è fattibile, almeno per i recettori della famiglia EGFR. Molto più piccole etichette specifiche sono noti in letteratura e can essere applicata anche per l'etichettatura intracellulare 31 ma quelli non sono comunemente usati. La lunghezza di tutta l'etichetta (EGF-biotina-streptavidina-QD) è di una dimensione simile come EGFR, e sufficientemente piccolo da poter rilevare il dimero. Inoltre, la procedura di etichettatura in due fasi descritto evita etichettatura indotta recettore clustering.
Il nostro metodo non è molto difficile, non più di microscopia a fluorescenza di proteine marcate. Tuttavia, un esperimento deve essere eseguito con grande attenzione, poiché il numero di passi e aggiunge un errore in uno dei passi può portare ad un fallimento completo nell'esperimento. Manipolazione dei microchip non è più noioso che la gestione delle reti di TEM, ma alcuni di formazione chip vuote è raccomandato. ESEM-stelo di cellule intere idrati è probabilmente l'aspetto più difficile, e richiede almeno un operatore esperto e diversi giorni di pratica per raggiungere una risoluzione di circa 3 nm come necessario per visualizzare i QD. Radiazioni digal'età del campione in esame presenta un rischio. La pressione e la temperatura devono essere attentamente sorvegliato per mantenere uno strato di acqua. Inoltre, lo spessore dello strato di acqua può variare tra le celle. Si consiglia di monitorare la presenza dello strato di acqua utilizzando il rivelatore di elettroni gassosa sopra il campione, come descritto altrove 6. Regioni cellulari dovrebbero essere ripreso solo una volta o due volte per evitare danni.
Un limite fondamentale del metodo è che informazioni ad alta risoluzione sulla ultrastruttura è assente. Altre tecniche, per esempio, crio TEM, sono necessari per studiare la struttura proteica, e l'ultrastruttura cellulare 15. In secondo luogo, studiando l'interazione dinamica di un multiplo di proteine in cellule vive in microscopio time-lapse non è fattibile a causa dei danni da radiazioni, e richiede state-of-the-art di microscopia ottica 23. Attualmente, il nostro metodo non è in grado di determinare il livello assoluto di dimeri poiché lefficienza Abeling è nota, ma ci aspettiamo di aggiungere tali dati in futuro. E 'tuttavia possibile dire se sono presenti o meno dimeri. Dalla letteratura è noto che anche un'efficienza etichettatura circa il 15% è sufficiente a rilevare dimeri con significatività statistica sufficiente 32.
E 'facilmente possibile studiare altri recettori di membrana tramite il loro ligando, con frammenti Fab biotinilati di anticorpi specifici, o tramite altri piccoli linker 7 utilizzando il protocollo di etichettatura in due fasi descritto. Dal momento che abbiamo già dimostrato che due diversi colori (dimensioni) di QD può essere utilizzato, e l'etichettatura delle nanoparticelle d'oro è stato utilizzato nel lavoro precedente 6, sembra possibile etichettare più specie di proteine nello stesso esperimento. La sfida chiave per lo studio della stechiometria di più specie proteiche è garantire un'efficienza etichettatura simile per entrambe le specie o almeno una normalizzazione della stechiometria relativa ottenuta sul rispettoive efficienze di etichettatura. Tuttavia, le due QDs diversi utilizzati in questo studio non sembrano differire molto dell'efficienza etichettatura (vedi figure 2 e 4). Il metodo descritto coinvolge etichettatura in due fasi con QD, e microscopia a fluorescenza correlativa e ESEM-STEM presenta un metodo praticabile per studiare la complessa interazione delle proteine di membrana nelle membrane plasmatiche delle cellule intatte intere.
The authors have nothing to disclose.
We thank E. Arzt for his support through INM, M. Koch for help with the ESEM, and DENS Solutions for providing the microchips. Research in part supported by the Leibniz Competition 2013.
Inverted fluorescence microscope | Leica | AF6000 + DMI6000B | |
ESEM | FEI Company | Quanta 400 FEG | |
Chemicals | |||
DMEM (1x) + GlutaMax + glucose + pyruvate | Gibco | 31966-021 | |
DPBS (1x) – Calcium chloride – Magnesium chlorid | Gibco | 14190-144 | |
Fetal bovine serum, Performance Plus (FBS) | Gibco | 16000-036 | |
Cellstripper | Mediatech, Inc. | 25-056 Cl | |
Water, chromasolv Plus for HPLC | Sigma-Aldrich | 34877-2.5L | |
PBS Roti-Stock 10x PBS | Carl Roth | 1058.1 | |
Ethanol, Rotisolv HPLC grade | Carl Roth | P076.2 | |
Albumin Fraction V, biotin-free (BSA) | Carl Roth | O163.2 | |
Gelatin, from cold water fish skin | Sigma-Aldrich | G7041-500G | |
Glycine | Carl Roth | T873.1 | |
shoul | Molecular Probes | E3477 | |
Sodium teraborate decahydrate | Sigma-Aldrich | S9640-500G | |
Boric acid | Sigma-Aldrich | B6768-500G | |
Qdot 655 streptavidin conjugate | Molecular Probes | Q10121MP | |
Qdot 800 streptavidin conjugate | Molecular Probes | Q10173MP | |
Materials | |||
Silicon microchips with silicon nitride membranes | DENS Solutions | Custom made | |
of 50 nm thickness and dimensions of 50 µm x 0.40 mm |