L'étude de la Stœchiométrie Epidermal Growth Factor Receptor dans des cellules intactes en utilisant la microscopie corrélative

Summary

This protocol describes the labeling of epidermal growth factor receptor (EGFR) on COS7 fibroblast cells, and subsequent correlative light- and electron microscopy of whole cells in hydrated state. The label contained fluorescent quantum dots. The protocol can be used to study the stoichiometry of EGFR at the single molecule level.

Abstract

Ce protocole décrit le marquage du récepteur du facteur de croissance épidermique (EGFR) sur des cellules de fibroblastes COS7, et après la microscopie par fluorescence et par microscopie corrélative électronique à balayage environnemental (ESEM) de cellules entières à l'état hydraté. Les points quantiques (QD fluorescents) ont été couplés à l'EGFR par un protocole de marquage en deux étapes, fournissant une protéine de marquage spécifique et efficace, tout en évitant le regroupement induite étiquette du récepteur. La microscopie à fluorescence a fourni des images aperçu des emplacements cellulaires de l'EGFR. Le détecteur microscopie électronique en transmission à balayage (STEM) a été utilisé pour détecter les étiquettes QD avec une résolution nanométrique. Les images résultantes fournissent des données corrélatives de la distribution cellulaire de l'EGFR, et la stoechiométrie à l'échelle moléculaire unique dans le contexte naturel de la cellule intacte hydraté. Images ESEM-STEM a révélé le récepteur d'être présent en tant que monomère, comme homodimère, et en petites grappes. Étiquetage avec deux points quantiques différents,soit un émettant à 655 nm et à 800 révélé des résultats caractéristiques similaires.

Introduction

Une nouvelle approche a été introduite récemment, à des cellules entières d'image avec des protéines marquées à l'état liquide à l'aide STEM ^1-3, ou la microscopie de fluorescence corrélative et la tige ^4-7. Cette méthodologie est capable d'étudier la répartition spatiale des protéines membranaires et des protéines, y compris des complexes de leur stoechiométrie au niveau de la molécule unique dans les membranes plasmiques de cellules entières intactes. Ici, nous décrivons un protocole impliquant un étiquetage spécifique en deux étapes de protéines réceptrices avec des points quantiques fluorescents (QD) ^8, et la microscopie optique et corrélative ESEM-STEM. A titre d'exemple, nous avons étudié l'EGFR, une protéine membranaire qui appartient à la superfamille de la protéine kinase. Lors de la liaison ligand, le récepteur active, puis forme un dimère avec un autre EGFR activé; la cascade de signaux ultérieure entraîne la prolifération des cellules ^9. Des mutations conduisant à l'expression de l'EGFR ou activité anormale jouent un rôle central dans de nombreux types de cancer ^10. StudyIng l'agencement spatial de ce récepteur membranaire dans des cellules entières de contexte fournit des informations importantes sur sa fonction d'éventuelles modifications de ceux-ci et ^{de 11 à 14.} Mais il reste difficile de sonder la répartition des monomères de l'EGFR, dimères, et les grappes directement sur ​​un niveau (sous-) cellulaire avec des méthodes de microscopie biochemical- ou conventionnelles ^15. Notre méthode est capable de visualiser EGFR avec une résolution spatiale de quelques nanomètres telles que la localisation des protéines dans un complexe peut être déterminée. Plus important encore, les informations obtenues sur la distribution stoechiométrique se rapporte à la situation native de la protéine dans la cellule intacte.

Afin de parvenir à une courte distance entre l'étiquette et le récepteur, l'EGFR a été directement marqué par son ligand EGF, à l'aide d'une liaison biotine-streptavidine à une QD. Ce marqueur peut être détecté par microscopie par fluorescence à la fois et électrons. Nous avons utilisé cette étiquette pour l'imagerie corrélative des cellules COS7 enliquide enfermé dans une chambre microfluidique précédemment ^1,16,17. Cependant, en raison d'un multiple de streptavidine molécules par QD, cette étiquette peut induire le regroupement des récepteurs, conduisant à une efficacité de marquage faible ou expériences plutôt coûteux, et il est impossible de conclure sur la stoechiométrie de la protéine sous enquête. Regroupement des récepteurs induite Label peut être évitée en utilisant la procédure d'étiquetage en deux étapes présentée ici, résultant en une sonde comprenant EGF biotinylé à laquelle une seule streptavidine-points quantiques (STR-QD) est couplé. Les cellules sont d'abord incubées avec EGF biotinylé, puis fixées. L'étape de fixation détermine le point à partir duquel les processus de protéines sont arrêtés (en fonction de la vitesse de la fixation) de temps. STR-QD est appliquée par la suite en tant que deuxième étape du protocole de marquage. Clustering n'a pas lieu puisque le mouvement de la membrane dynamique des protéines est encombrée lorsque les protéines sont fixés. En outre, la solution STR-QD, qui est leplus coûteux composant de l'expérience, peut être appliquée dans une faible concentration optimisée, et cette deuxième étape de marquage est pas cruciale temps, à savoir la QD peut être couplé à plusieurs minutes.

Pour étudier la stoechiométrie de l'EGFR tel que distribué dans des cellules entières, des échantillons cellulaires ont été préparés sur des micropuces de silicium ^18. Après l'application de l'étiquetage de QD en deux étapes, et l'enregistrement d'images de microscopie par fluorescence, les cellules ont été rincées avec de l'eau pure, et imagés en état ​​hydraté en utilisant ESEM-STEM ^19. Les images corrélatifs résultant fournissent des informations sur la distribution de l'EGFR cellulaire, et la stoechiométrie dans leur contexte naturel des cellules hydratées. Une méthode similaire a été utilisée pour étudier les protéines HER2 dans les cellules du cancer du sein dans une étude récente ^7.

Protocol

1. Préparation de l'étiquetage et de fixation Réactifs Préparer du tampon de marquage (BSA-PBS-GEL) en utilisant une solution saline tamponnée au phosphate autoclave, pH 7,4 (PBS). Supplément avec 1% de BSA (albumine bovine fraction V, exempte de biotine) et 0,2% de gélatine (GEL, à partir de peau de poisson d'eau froide) et le vortex / bien secouer. Note: peut être stocké pendant ~ 5 jours à 4 ° C. Préparer du tampon de lavage (PBS-BSA) à partir autoclave une solution saline tamponnée au phosphate, pH 7,4. Supplément avec 1% de BSA et vortex / bien secouer. Note: peut être stocké pendant ~ 5 jours à 4 ° C. Préparez 50 mM de tampon borate (BB) à partir de 200 mM de solution stock d'acide borique, pH ajusté à 8,3 avec tétraborate de sodium 200 mM. Note: peut être stocké pendant ~ 12 mois à 4 ° C. Préparez cacodylate 0,1 M tampon (CB) de 0,2 M sodium cacodylate solution stock, pH ajusté à 7,4, additionné de 0,1 M de saccharose. Remarque: solution boursier ouvert peut être stocké pendant ~ 5 jours à 4 ° C. Préparer 0,1 M de glycine dans du PBS (GLY-PBS). Note: peut être stocké pendant ~ 2 mois à 4 ° C. Préparer 3% de paraformaldehyde dans CB (3% PFA) du flacon fraîchement préparé ou ouverte de 16% PFA, solution de réserve, le grade EM. Remarque: solution boursier ouvert peut être stocké pendant ~ 5 jours à 4 ° C. Préparer glutaraldéhyde à 2% en CB (2% GA) à partir fraîchement préparé (ou ouvert flacon de) 25% GA solution stock, qualité EM. Remarque: solution boursier ouvert peut être stocké pendant ~ 5 jours à 4 ° C. Préparer la solution d'étiquetage 300 nM EGF-biotine Diluer la solution mère de l'EGF-biotine 6 pm dans BSA-GEL-PBS, utiliser un volume de 100-200 pi par micropuce. Utiliser dans quelques heures. Préparer 10 solution d'étiquetage nM STR-QD Centrifuger la solution stock streptavidine-QD pendant 4 min à 8000 xg, prendre surnageant et diluer à 1:10 dans BB. Différents types de boîtes quantiques peuvent être utilisés, par exemple, QD655, ou QD800. Diluer à la concentration finale de BSA-GEL-PBS, utilisez 75-100 ul par micropuce. Utiliser dansquelques heures. 2. Préparation nitrure de silicium membrane Microchips Nettoyer une lame de verre de microscope, tel qu'il est utilisé pour la microscopie optique, avec un mouchoir en chambre propre et chromatographie liquide à haute performance (CLHP) éthanol de qualité. Dans un plan de travail à flux laminaire avec un niveau de poussière faible, ouvrir une boîte de Pétri de diamètre 100 mm, et de jeter le verre de microscope nettoyé dans le plat; laisser le récipient ouvert. Avec des pincettes propres, de préférence revêtus de fibre de carbone ou autre revêtement, prendre 4-10 puces avec de fines (50 nm) membranes de nitrure de silicium, l'un après l'autre, en dehors de leur zone de stockage et sur la lame de verre. Prenez les puces doucement à leurs côtés et évitez de toucher le côté supérieur fragile, constitué de la membrane de nitrure de silicium minces. Prenez grand soin de toujours garder le côté de la membrane et ne le touchez pas. Remarque: Les puces devraient être de forme rectangulaire et ont des bords plats perpendiculairement à leur nitrure de silicium recouvertface, de sorte qu'ils peuvent être saisis facilement. Fermez le couvercle de la boîte de Pétri et l'amener à une hotte. Obtenez un nouveau tissu de chambre propre et le déposer à côté de la boîte de Pétri. Préparer deux béchers de 200 ml propre de verre par remplissage avec une 50 à 70 ml d'acétone, et l'autre avec un volume similaire de l'éthanol, à la fois de qualité HPLC. Transférer les puces de la première lame de verre sur le tissu de salle blanche. Du tissu, micropuces transférer un par un dans le premier bêcher avec de l'acétone pour enlever la couche de résist de protection. Attendre 2 min, tout en déplaçant doucement le bécher à quelques reprises pour assurer que les puces sont bien rincés. Transférer les puces directement dans le bécher avec de l'éthanol, sans les laisser sécher. Attendre 2 min. Puis transférer le bécher sur l'établi à flux laminaire. Obtenez un nouveau tissu de salle blanche. Transférer les jetons sur le tissu et les laisser sécher pendant quelques minutes. Transférer les puces sur la lame de verre dans la boîte de Pétri, fermer le plat,et l'amener à l'épurateur à plasma. Déposer la lame de verre avec les puces dans le nettoyeur à plasma. Exécuter un programme de nettoyage de 5 minutes pour rendre la surface de la membrane de nitrure de silicium hydrophile. Remarque: Les paramètres appropriés appliqués pour notre nettoyeur à plasma sont: 70 mTorr, débit de gaz de 11,5 sccm O 2 et de 35,0 SCCM pour Ar, 50 W fréquence radio avant (RF) cible, 5 W gamme RF et max. RF réfléchie. Mettez la lame de verre avec la puce de retour dans la boîte de Pétri, et de fermer son couvercle. Prenez soin de garder les puces stérile à partir de maintenant. Examiner les domaines des puces de fenêtres sous un microscope optique pour les ruptures de la membrane possibles ou des particules de poussière restantes. Apportez la boîte de Pétri à l'établi à flux laminaire. Placez les éléments suivants dans l'atelier à flux laminaire: Tubes / flacons stérilisés 0,01% de poly-L-lysine solution (. PLL, mol wt 150,000-300,000, stérile filtré, et la culture de la cellule testée), HPLCl'eau de qualité, milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM) complété avec 10% de sérum de veau fœtal, DMEM sans sérum, un nouveau tissu de salle blanche, une plaque de 24 puits stérile (une plaque de 12 puits peut également être utilisé), une solution stérile 96- ainsi la plaque, les embouts de pipettes stériles, une pipette, et plat, pointe arrondie, une pince à épiler. Prenez la plaque de 24 puits, et de remplir un puits avec PLL, et deux puits avec de l'eau de qualité HPLC, utilisent une env. volume de 1 ml par puits. Prenez la plaque de 96 puits et de remplir pour chaque puce de deux puits avec du sérum DMEM complété et un puits avec du DMEM sans sérum, utiliser un env. volume de 200 pi par puits. A partir de maintenant utiliser des pinces avec embouts stériles pour gérer les puces. Atteindre cet objectif, par exemple, par une brève flamboyante et le refroidissement suite au large des pointes de la pince à épiler. Première transférer les puces de la lame de verre sur le tissu de salle blanche. Du tissu, de transférer jusqu'à six puces dans le PLL-bien remplie, incuber les puces pendant 5 min. Pase: Pour une expérience avec plus de puces, remplissez puits supplémentaires dans la plaque de 24 puits. Puis rincer les puces en les plaçant, une par une, en bien le premier rempli d'eau, et de là dans le second puits rempli d'eau. Ne laissez pas les puces dans l'eau plus longtemps que d'une minute pour éviter l'élimination des PLL. Enfin placer individuellement dans les puits DMEM-remplis de la plaque de 96 puits. Stocker la plaque à 96 puits dans du CO 2 incubateur jusqu'à ce que la suspension cellulaire est préparée. 3. Préparation des cellules sur des micropuces Effectuer une sous-culture de cellules COS7 à préparer une suspension de cellules avec une concentration d'env. 5 × 10 5 cellules / ml. Assurez-vous que les cellules sont dispersées mono. Prenez la plaque de 96 puits avec les puces et ajouter une goutte de suspension cellulaire à chaque puce. Attendez 5 min. Commencer à examiner les domaines des puces de fenêtres avec un microscope inversé à choose le bon moment pour le transférer dans un nouveau puits avec du DMEM sans sérum. Remarque: Une bonne densité de cellules est réalisée à environ 2500 cellules par une 2 um zone, ce qui correspond à 24 cellules COS7 sur une taille de fenêtre de 150 x 400 pm. Des densités de cellules plus élevées ont le risque d'entraver l'aplatissement maximal des cellules. Soyez conscient que, après une cellule est installée sur la membrane de NAS, il a besoin de 3-5 min de développer une adhérence suffisante pour résister flottant au large pendant le transfert dans le nouveau puits. Transfert puce à l'autre bien quand suffisamment de cellules ont collé sur la fenêtre. Gardez les puces toujours avec les cellules vers le haut et d'éviter toute touchante de ce côté. Après le transfert, d'examiner à nouveau chaque fenêtre de la micropuce. Si trop de cellules ont été lavés et le nombre de cellules restantes sont insuffisantes, re-triturer la suspension cellulaire (pour briser les mottes de cellules nouvellement formées) et répétez les étapes 3.1-3.5. Lorsque toutes les puces transférés ont assezcellules adhérentes sur leurs zones de la fenêtre, transférer les jetons dans le dernier puits avec du DMEM sans sérum. Placer la plaque de 96 puits de retour dans le CO 2 incubateur et laisser les cellules récupérer et aplatir pour plusieurs heures, le meilleur O / N. 4. EGFR étiquetage, fixation et microscopie de fluorescence Pour les étapes suivantes, utiliser un 96 puits et une plaque de 24 puits. Pré-remplir les puits avec les solutions respectifs, et utiliser une ligne ou une colonne par micropuce. La plaque ainsi 24 est utilisé sous la hotte pendant les étapes de fixation avec CB, PFA et GA. Toujours transférer des puces avec les cellules vers le haut et éviter toute touchante de ce côté. Rincer puces en plaçant les puces dans un puits avec des produits frais BSA-GEL-PBS, puis placez plaque de 96 puits dans un incubateur à 37 ° C pendant 5 min. Incuber avec 300 nM solution de EGF-biotine pendant 3 min à 37 ° C. Parce que les cellules vont commencer endocytose des EGFR EGF marqué, procéder aussi rapidement que possible de Ste4,4 p. Rincer 3 fois avec PBS, et 1 fois avec CB (maintenant la plaque 96 puits est à nouveau à la température ambiante). Incuber à 3% de PFA pendant 10 min. Rincer une fois avec des puces CB, et 3 fois avec du PBS. Incuber dans GLY-PBS pendant 2 minutes, rincer 2 fois avec du PBS une fois. Incuber à 10 nM STR-QD pendant 10 min. Rincer 4 fois avec de la BSA-PBS. Immerger une puce dans une boîte de 35 mm à fond de verre pré-remplies avec de la BSA-PBS à température ambiante. Acquérir contraste interférentiel différentiel (DIC) des images et des images de fluorescence des cellules QD-étiquetés. Utilisez un objectif de l'air 40X pour les images aperçu de cellules marquées par QD655. Utilisez un objectif à immersion d'huile (par exemple, 63X) pour permettre la collecte plus efficace de la lumière de fluorescence émise; Cela est particulièrement nécessaire lors de l'imagerie des cellules marquées avec QD800. Utilisez un cube de filtre qui expose les points quantiques à la lumière d'excitation de fluorescence entre 340 et 380 nm, et permet la collecte de la lumière émise au-dessus de 420 nm suitable pour la plupart des boîtes quantiques (filtre cube A dans ce cas). Réduire l'intensité de la lumière pour éviter la lumière trop intense qui pourrait endommager l'échantillon. Réglez le temps d'exposition à au moins 300 ms, de sorte que les signaux de tous les points quantiques sont capturés, notant que la fluorescence de QDs a un comportement à clignoter. Ajuster l'intensité lumineuse, et l'amplification de fournir des images lumineuses, sans bruit de l'image visible, tout en minimisant l'intensité lumineuse. Remarque: Vous pouvez également, plus court temps d'exposition peut être utilisée que si la série d'images sont prises de la même région. Ces séries peut être traitée pour donner une image de projection maximale, conduisant à la moyenne et donc la réduction du bruit de l'image résultante. Placez la puce imagé arrière (cellules vers le haut) dans un puits d'une plaque de 96 puits rempli de BSA-PBS. Rincer micropuces 1 fois dans CB. Incuber à 2% GA pendant 10 min. Rincez 1 fois en CB, et 3 fois avec BSA-PBS. Micropuces de magasins jusqu'à ESEM iforgemagie, de BSA-PBS puits pré-rempli d'une nouvelle plaque de 96 puits. Pour chaque puce remplir une rangée de quatre puits avec de l'eau de qualité HPLC. Note: Les échantillons peuvent être conservés à 4 ° C pendant plusieurs semaines, cependant, les meilleurs résultats sont obtenus lorsque la série de formation d'image complète est effectuée dans les deux jours. QDs va lentement commencer à se détacher de l'échantillon, il est donc recommandé de ne pas attendre plus de 10 jours avant l'imagerie ESEM est fait. Remarque: Les images de fluorescence sont stockées pour une analyse ultérieure. Les positions des cellules dans les images peuvent facilement être mises en corrélation avec des images de microscopie électronique par l'intermédiaire de la localisation des coins de la fenêtre de mesure de SiN et les positions relatives des coins. Remarque: Il est conseillé d'imprimer des images de fluorescence de haute qualité et de les utiliser à des fins d'orientation lors de l'enregistrement des images ESEM. 5. Wet ESEM-STEM de cellules entières Préparer l'ESEM pour STEM humide Montez l'électron d secondaire gazeuxetector (gsed), et le stade Peltier, contenant le détecteur STEM (situé sous l'échantillon). Démarrez l'écoulement de l'eau de refroidissement à travers la scène, et de régler la température à 3 ° C. Définir les coordonnées XY de la scène à zéro, et d'ajuster la distance de travail d'environ 6 mm. Au cours de l'imagerie de ESEM, maintenir la plaque de 96 puits avec les puces refroidir, par exemple sur des éléments de refroidissement congelés, dans une boîte en polystyrène. Pour charger un échantillon dans l'étape ESEM-STEM prérefroidi, prendre la plaque de 96 puits sur le récipient de refroidissement et placez-le près de la scène ESEM ouvert. Mettez un nouveau tissu de salle blanche à côté d'elle. Rincer rapidement une puce (avec les cellules vers le haut) par trempage quatre fois, chaque fois pendant environ une seconde, dans un puits rempli d'eau de qualité HPLC. Éponger l'arrière de la brièvement à puce sur le tissu de chambre propre et placer la puce dans la phase pré-refroidie. Assurez-vous que les cellules restent humides, cela peut êtrereconnu par une surface réfléchissante (séchage des résultats dans une surface mate). Mouiller la surface de l'échantillon avec 3 ul d'eau de qualité HPLC refroidi (veillez à ne pas toucher la surface avec la pointe de la pipette), et de fixer l'échantillon dans le stade. Placez trois gouttelettes d'eau supplémentaires 3 pi sur la scène proche de l'échantillon. Fermez la chambre d'échantillon Purger la chambre de l'échantillon par le vélo de la pression cinq fois entre 800 et 1500 Pa. Fin de la randonnée à vélo avec 800 Pa. Mettez le faisceau d'électrons (30 kV) sur et d'examiner l'échantillon sous le grossissement le plus faible avec les deux détecteurs, à savoir les gsed, et le détecteur STEM pour rechercher l'emplacement de la fenêtre de la micropuce. Remarque: Si la couche d'eau est trop épaisse, la fenêtre peut ne pas être visible. Dans ce cas, commencer à abaisser la pression à 760 Pa et attendre quelques minutes. La fenêtre devient visible avec le gsed. Positionner la fenêtre de SiN membrane dans le centre de l'image en déplaçant le SPECIMen scène et réduire la pression à 750-720 Pa. Remarque: Lorsque la couche d'eau est assez mince, la fenêtre devient également visible avec le détecteur STEM. A partir de maintenant utilisent le segment noir du détecteur STEM sur le terrain pour enregistrer des images. Tout d'abord, acquérir une ou deux images montrant toutes les cellules de la zone complète de la fenêtre. Comparer ces images ESEM avec les images de microscopie optique, localiser les coins de la fenêtre SiN. Corréler les cadres des deux modalités de microscopie de coordonnées en comparant le grossissement, la rotation et la mise en miroir possible. Repérez les mêmes cellules dans les deux images. Sélectionnez les particules de saleté très petites ou une région de la cellule de petites fonctionnalités pour ajuster les paramètres d'imagerie, telles que la hauteur eucentrique, la mise au point fine et la correction de lentille stigmatisation. Travailler à un grossissement d'au moins 50.000X, utilisez un courant de sonde d'électrons autour de 0,6 nA, un temps de 30 ms pixel-séjour, et une taille d'image de 1024 x 884 pixels. Remarque: D'autres paramètres peuvent également be utilisé aussi longtemps que on évite une augmentation de la dose d'électrons. Remarque: Même lorsque l'on travaille très propre, les surfaces de puce sera dans la pratique toujours contenir certaines particules de saleté, parce que le protocole ne soit pas exécuté dans un environnement de salle blanche. Pour enregistrer des images souches à partir de cellules de QD marqué, se référer aux images de fluorescence et de choisir une cellule d'intérêt. Remarque: Il est préférable de commencer avec une cellule montrant des signaux forts de QD. Enregistrer une image d'ensemble de tige de cette cellule. Aller à une région périphérique où la frontière de la cellule est visible et zoomer pour atteindre 50.000X grossissement. Enregistrez les images montrant les points quantiques individuels, utilisez pixel temps de séjour de 20-30 microsecondes. Afin d'éviter les dommages de rayonnement, l'image chaque région qu'une seule fois avec un fort grossissement. Remarque: Habituellement, à ce stade, à la fois, le foyer et la correction de la stigmatisation, besoin d'un peu de réglage fin. Après l'enregistrement d'un nombre suffisant d'images à fort grossissement, zoom-out, et accahier autre image de liste de STEM, représentant les régions simplement enregistrées avec à fort grossissement des rectangles sombres. Remarque: Ces images aperçu serviront plus tard pour corréler ESEM et de fluorescence images et de déterminer l'emplacement précis des images à fort grossissement dans le contexte cellulaire. Passez à la prochaine cellule d'intérêt, commencer avec une image d'ensemble, enregistrer une série d'images à fort grossissement, et se terminer par une image d'ensemble. A la fin d'une session de formation d'image ESEM, augmenter la pression de 850 à 900 Pa avant de commencer à évacuer la chambre. Remarque: Cette augmentation de la pression améliore la chance de récupérer la puce avec une surface encore mouillée; Toutefois, cela ne peut pas toujours être atteint. Un échantillon qui n'a jamais été séché peut être restauré en BSA-PBS et, si désiré, une nouvelle enquête dans le ESEM à un moment ultérieur.

Representative Results

La figure 1 et 2 illustrent des images représentatives de QD655 marqué, EGFR lié à la membrane dans visualisées intactes, des cellules COS-7 entièrement hydratées cellules. L'image DIC sur la figure 1 une donne une impression de la topographie de la membrane des cellules, et l'image de fluorescence correspondant à la figure 1b montre la répartition de l'EGFR après 3 min de EGF-biotine incubation. La figure 1A et B sont chacun cousues ensemble de deux les images enregistrées avec un objectif de l'air 40X. L'EGFR activé EGF est répartie sur toute la surface cellulaire. Dans la plupart des cellules une légère amélioration de la fluorescence (figure 1B) peut être vu sur les bords de la cellule, indiquant une présence accrue de l'EGFR au niveau local 20. Des expériences témoins effectuées en utilisant un protocole similaire dignes de confiance marquage spécifique de l'EGFR (données non présentées). Ces contrôles suivants: 1) un marquage témoin sans incubation préalable de la CELLS avec EGF-biotine, à savoir, que l'incubation avec STR-QD, et 2) une incubation avec des non-biotinylé EGF et STR-QD. Les trois cellules marquées avec des rectangles ont été étudiés plus avec ESEM-STEM. Les images ESEM-SOUCHES représentées sur la figure 1C – E présentent de faibles aperçus d'agrandissement de ces cellules. Ces images de transmission reflètent cellules entières dans un état hydraté avec mince couche d'eau résidant sur la cellule placée sur une puce de silicium avec du nitrure de silicium (SiN) fenêtre de visualisation. La chambre à vide à la vapeur d'eau contenue au microscope, et l'équilibre entre la température et la pression échantillon a été ajusté à maintenir une mince couche de liquide sur les cellules. Les cellules individuelles peuvent être facilement reconnus en raison de leur forme et l'emplacement de la fenêtre de la membrane SiN. Les images ESEM-SOUCHES faible grossissement révèlent des structures fines, comme filopodia, partant du bord de la cellule vers les cellules voisines, et certaines structuresà l'intérieur des régions cellulaires plus fines. Régions cellulaires centrale épaisse dont le noyau apparaissent en blanc parce que la transmission à travers l'échantillon est pas possible pour des électrons de l'énergie utilisée (30 keV). Haute résolution images ESEM-STEM ont été enregistrées dans les régions périphériques, plus minces. La résolution spatiale pour ESEM-STEM de nanoparticules dans les régions minces de cellules dans une fine couche de liquide a été déterminée dans une étude précédente de 6 à élever à 3 nm. Quatre images haute résolution présentés dans la figure 2A – D ont été enregistrés à l'emplacement des petits rectangles de la figure 1C – E. Le grossissement utilisé était suffisante pour discerner les points quantiques individuels, apparaissant, tiges en forme de balles que lumineuses, chacune liée à un individu EGFR. Le QD655 a des dimensions typiques de 6 x 14 nm 2. La figure 2A (correspondant à la zone rectangulaire indiqué sur la cellule dans Figure 1C) montre étiquettes QD sur une membrane replient diagonale traversant l'image. Cette structure de membrane a une densité supérieure à celle de l'EGFR les régions entourant la membrane. À plusieurs endroits, deux étiquettes étaient à proximité. Deux exemples avec des distances de 20 et 24 nm sont indiquées par des flèches. Ces paires d'étiquettes sont interprétés comme appartenant à des dimères de l'EGFR. La figure 2B montre un exemple par rapport au bord d'une cellule (figure 1D, le rectangle à gauche), les monomères de l'EGFR et de dimères peuvent être regardé aussi. La figure 2C (figure 1C, le rectangle à droite) a été enregistré d'une région avec un signal de fluorescence plus faible, à savoir, la densité de l'EGFR inférieur. Néanmoins, l'EGFR a également été trouvé ici, dans dimères ainsi. En outre, deux groupes de 10 ou 11 EGFR étaient présents (voir ellipses). Figure 2D montre un autre exemple d'un pli de la membrane (figure 1E) avec de petites grappes, y compris 5-6 EGFR, en plus de plusieurs monomèreset dimères. Comme un exemple du genre d'information qui peut être obtenu à partir de ces données, la paire fonction de corrélation 21 g (x) a été déterminée pour tous les postes de l'étiquette de la figure 2. Notez que cette analyse ne fait pas partie de ce protocole et la procédure a été décrite ailleurs 6,7. g (x) est une mesure de la probabilité d'une particule se trouve à une certaine distance radiale à partir d'une particule x de référence. g (x) = 1 représente une distribution aléatoire, et une valeur plus grande est la preuve pour le clustering. Les positions d'un total de 210 étiquettes ont été automatiquement détectés dans les quatre images de la figure 2A-D, et g (x) a été calculée en utilisant une taille de bin de 5 nm et un filtre de lissage avec une largeur de bande de 10 nm. La courbe g (x) (figure 3) montre un centre à centre QD distance préférée de 25 nm. EGFR ne sont donc pas orientées de manière aléatoire, mais une fraction notable de leur réside à cette distance préférée. D'un approximatmodèle moléculaire e 6 (figure 3 en médaillon), nous estimons que la distance de centre à centre entre le QD et la poche de liaison EGF revient à ~ la distance 14 nm, et de centre à centre entre les deux points quantiques attachés à un dimère de l'EGFR à ~ 27 nm être (cette valeur est susceptible de varier par quelques nanomètres raison de la flexibilité du lieur). La distance d'étiquette préféré est donc compatible avec la distance de l'étiquette prévue pour le dimère de l'EGFR à l'intérieur de la précision de la méthode. Le g (x) est courbe supérieur à l'unité pour la distance maximale de 300 nm, indiquant la présence de groupements, cohérent avec les données. Cette analyse montre que la stoechiométrie de l'EGFR peut être étudié avec notre procédé. La figure 4 montre un résultat similaire à la Figure 2, sauf que le marquage a été réalisé avec EGF-QD800, et un objectif 63X à immersion d'huile a été utilisée pour l'image de fluorescence. Ces données confirment que ces résultats typiques sont également présents lorsquel'étiquetage de l'EGFR se fait avec les points quantiques, qui émettent dans le spectre proche rouge. La figure 4A est l'image de fluorescence d'une cellule représentative, la figure 4B montre la même cellule en mode aperçu ESEM-STEM et la figure 4C est une image de grossissement 150.000 x, enregistré à la frontière de la membrane supérieure de la cellule (voir le rectangle dans la figure 4B). Similaire à la figure 2A et D, les images saisissent EGFR QD marqué sur un pli de la membrane et montre récepteurs monomères, dimères, et en grappes. Notez que l'électron noyau QD dense apparaît un peu plus petite et plus ronde que les noyaux des boîtes quantiques émettant à 655 nm, compatible avec leur petite taille du noyau de 22 ~ 5 nm. Figure 1. corrélative DIC, fluorescence et ESEM-STEM d'EGF-QD655 étiqueté EGFR sur COS-7 entièrement hydratés cellules </stRong>. image (A) DIC des cellules cultivées sur la zone de la fenêtre de la membrane péché, donnant une impression topographique de la membrane plasmique. (B) l'image de fluorescence montrant des cellules sur la fenêtre de la membrane de SiN situé au centre (marqué par le rectangle en pointillés). (C – E) Trois ESEM-SOUCHES faible grossissement des images des cellules marquées avec des rectangles dans A et B. Ces images vue d'ensemble de la cellule servent à déterminer l'emplacement précis des images enregistrées ultérieurement à haute résolution. L'emplacement de quatre images à haute résolution (Figure 2A-D) sont marqués par des rectangles blancs. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure. <strong> Figure 2. haute résolution des images ESEM-SOUCHES représentant membranaires EGFR. (A) Microscopie à 75,000X agrandissement de la zone marquée dans la figure 1B. Beaucoup de monomères sont visibles. Plusieurs dimères sont indiqués par les flèches. (C) des images acquises à 50,000X grossissement de gauche (B) et, respectivement, les zones membranaires marqués à droite sur la figure 1C. Des grappes de EGFR sont décrites. L'image (D) enregistré avec 50,000X grossissement à l'emplacement marqué à la figure 1D. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Figure 3. Paire fonction de corrélation g (x) en tant que fonction de la distance radiale x déterminée pour l'inter-parti distances CLE de toutes les 210 étiquettes détectés à la figure 2A-D. Le pic à 25 nm indique qu'un QD distance de centre-à-centre a beaucoup plus de chances de se produire que aléatoire, lequel ag (x) = 1 indique un hasard. La ligne en pointillé est un guide à l'œil représentant g (x) d'une distribution aléatoire. L'encart montre un modèle moléculaire approximatif du dimère de l'EGFR avec EGF lié et revêtues de streptavidine QDs fixés par l'intermédiaire de la biotine. Les modèles de la streptavidine, l'EGF et le EGFR ont été obtenus à partir de modèles de CPK du 1stp (streptavidine), 1EGF (EGF), 1NQL, 2JWA, 1M17, structures du RCSB Protein Protein Databank, créé par Jmol Version 1IVO et 2GS6 (EGFR) 12.2.15. Le modèle de la biotine est aussi dessiné dans RCSB Ligand Explorer version 1.0. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure. /53186/53186fig4.jpg "/> Figure 4. exemplaire COS-7 cellules marquées avec de l'EGF-QD800 et imagé avec fluorescence corrélative et ESEM-STEM. (A) image de fluorescence, (B) faible aperçu de grossissement d'image ESEM-STEM. (C) de l'image à haute résolution enregistrée à l'emplacement du rectangle en b au 150,000X grossissement. EGFR monomères, dimères, et en grappes sont détectés similaire à l'étiquetage avec EGF-QD655. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Discussion

L'étude de la distribution spatiale et la stoechiométrie des protéines membranaires, comme l'EGFR, dans des cellules entières de contexte fournit des informations importantes sur sa fonction d'éventuelles modifications de ceux-ci et ^{de 11 à 14.} Il est difficile d'étudier la distribution des monomères, des dimères, et des grappes directement sur ​​un niveau sous-cellulaire en utilisant des procédés biochimiques couramment utilisés, pour lesquels l'information est perdue sur la localisation de la protéine dans la cellule ou les cellules ^{de 15} différences entre les. Les méthodes de marquage décrites ici microscopie et permettent la visualisation des complexes protéiques sur une échelle de longueur de quelques nanomètres de sorte que sa stoechiométrie peut être étudiée dans le contexte de cellules intactes individuelles, ^4-7. Cela ne veut pas possible avec (résolution super) de microscopie optique ²³ car la résolution est insuffisante pour distinguer les molécules engagées dans un complexe protéique. Transfert Förster Resonance Energy (FRET) est une technique de moyenne d'ensemble <sup> 24, et ne détecte pas nécessairement les dimères et plus grappes de commande comme une conséquence de la courte portée de transfert d'énergie ^25. Dosages de ligature de proximité ²⁶ ne mesurent pas les distances et ne sont donc pas capables de distinguer entre une région cellulaire avec une densité élevée en protéines, inévitablement conduit à un certain nombre de proximités détecté par hasard, à partir d'une région cellulaire avec une densité de protéine similaire, mais contenant des protéines complexes présentant des distances distinctes entre les étiquettes. La haute résolution nécessaire pour visualiser les constituants de complexes de protéines est obtenue en microscopie électronique à transmission (MET). Cependant, TEM classique de cellules entières est limitée par l'exigence de minces échantillons / sections de tranchage à travers la membrane ²⁷ plasmatique, ou plasma membrane de rupture ou de déchirure de ^28,29 formées au hasard résultant en petits morceaux de membrane. La membrane plasmique est donc pas imagé dans son ensemble, ce qui conduit à un manqued'éventuellement cruciale informations de contexte cellulaire.

D'autres difficultés expérimentales pour l'étude de la protéine dans les cellules stoechiométrie proviennent de la protéine de marquage appliquée. Communément immunomarquage utilisé porte la difficulté que l'un-à-un entre le récepteur et la stoechiométrie étiquette ne peut être obtenu avec une sonde d'monovalent; ceci est pas le cas lorsque les anticorps primaires et secondaires sont nécessaires. Pour obtenir des informations sur la stoechiométrie de la protéine, il est nécessaire que la sonde se lie à un epitope unique sur le récepteur et dispose d'un site de liaison pour une sonde fluorescente ou un numéro atomique élevé nanoparticule de l'autre côté. En second lieu, la précision obtenue avec l'anticorps étiquetage est limitée en raison de leur grande taille ³⁰ à 30 nm, de sorte qu'une discrimination entre les protéines voisines simples, des homodimères ou des grandes grappes est impossible, du moins pour les récepteurs de la famille des EGFR. Beaucoup de petites étiquettes spécifiques sont connus dans la littérature et can être appliquée même pour l'étiquetage intracellulaire ³¹ mais ceux qui ne sont pas couramment utilisés. La longueur de l'ensemble étiquette (EGF-biotine-streptavidine-QD) est d'une dimension similaire à celle du EGFR, et suffisamment petit pour être en mesure de détecter le dimère. En outre, la procédure en deux étapes d'étiquetage décrit éviter l'étiquetage induit regroupement des récepteurs.

Notre méthode est pas très difficile, pas beaucoup plus que la microscopie de fluorescence de protéines marquées. Toutefois, un essai doit être effectué avec beaucoup de soin, étant donné que le nombre d'étapes et ajoute une erreur dans l'une des étapes peut conduire à un échec total dans l'expérience. Manipulation des micropuces est pas plus fastidieux que la manipulation des réseaux TEM mais certaines puces vides de formation est recommandée. ESEM-STEM des cellules hydratées entiers est probablement l'aspect le plus difficile, et nécessite au moins un opérateur qualifié et plusieurs jours de pratique afin de parvenir à une résolution d'environ 3 nm comme nécessaire pour visualiser les points quantiques. Radiation barrageâge de l'échantillon objet de l'enquête présente un risque. La pression et la température doivent être soigneusement surveillés pour maintenir une couche d'eau. En outre, l'épaisseur de la couche d'eau peut varier entre les cellules. Il est recommandé de surveiller la présence de la couche d'eau à l'aide du détecteur d'électrons gazeux au-dessus de l'échantillon, comme décrit par ailleurs ^6. Régions cellulaires ne devraient être imagées une ou deux fois pour éviter des dommages.

Une limitation essentielle du procédé est que l'information à haute résolution sur l'ultrastructure est absent. D'autres techniques, par exemple, cryo TEM, sont nécessaires pour étudier la structure de la protéine, et l'ultrastructure cellulaire ^15. Deuxièmement, l'étude de l'interaction dynamique d'un multiple de protéines dans des cellules vivantes en time-lapse microscope est pas possible en raison de dommages de rayonnement, et nécessite l'état de l'art de la microscopie optique ^23. Actuellement, notre procédé est pas capable de déterminer le niveau absolu de dimères depuis le lAbeling efficacité est inconnue, mais nous nous attendons à ajouter ces données à l'avenir. Il est néanmoins possible de dire si les dimères sont présents ou non. De la littérature est-elle connue, que même une efficacité de marquage d'environ 15% est suffisante pour détecter des dimères avec une signification statistique suffisante ^32.

Il est facilement possible d'étudier d'autres récepteurs membranaires par l'intermédiaire de leur ligand, par fragments Fab biotinylé d'anticorps spécifiques, ou par d'autres petits groupes de liaison ⁷ en utilisant le protocole d'étiquetage en deux étapes décrit. Comme nous avons déjà démontré que deux couleurs différentes (tailles) de points quantiques peuvent être utilisés, et l'étiquetage des nanoparticules d'or a été utilisé dans le travail avant ^6, il semble possible d'étiqueter les espèces de protéines multiples dans la même expérience. Le principal défi pour l'étude de la stoechiométrie des espèces protéiques multiples est d'assurer une efficacité de marquage similaire pour les deux espèces ou au moins une normalisation de la stoechiométrie relative obtenue sur le respective efficacité en matière d'étiquetage. Pourtant, les deux boîtes quantiques différents utilisés dans cette étude ne semblent pas différer beaucoup de l'efficacité de l'étiquetage (voir les figures 2 et 4). La méthode décrite impliquant étiquetage en deux étapes avec des points quantiques, et la microscopie par fluorescence et corrélative ESEM-STEM présente une méthode viable pour étudier l'interaction complexe de protéines membranaires dans les membranes plasmiques intactes de cellules entières.

Materials

Inverted fluorescence microscope	Leica	AF6000 + DMI6000B
ESEM	FEI Company	Quanta 400 FEG
Chemicals
DMEM (1x) + GlutaMax + glucose + pyruvate	Gibco	31966-021
DPBS (1x) – Calcium chloride – Magnesium chlorid	Gibco	14190-144
Fetal bovine serum, Performance Plus (FBS)	Gibco	16000-036
Cellstripper	Mediatech, Inc.	25-056 Cl
Water, chromasolv Plus for HPLC	Sigma-Aldrich	34877-2.5L
PBS Roti-Stock 10x PBS	Carl Roth	1058.1
Ethanol, Rotisolv HPLC grade	Carl Roth	P076.2
Albumin Fraction V, biotin-free (BSA)	Carl Roth	O163.2
Gelatin, from cold water fish skin	Sigma-Aldrich	G7041-500G
Glycine	Carl Roth	T873.1
shoul	Molecular Probes	E3477
Sodium teraborate decahydrate	Sigma-Aldrich	S9640-500G
Boric acid	Sigma-Aldrich	B6768-500G
Qdot 655 streptavidin conjugate	Molecular Probes	Q10121MP
Qdot 800 streptavidin conjugate	Molecular Probes	Q10173MP
Materials
Silicon microchips with silicon nitride membranes	DENS Solutions	Custom made
of 50 nm thickness and dimensions of 50 µm x 0.40 mm