This protocol describes the labeling of epidermal growth factor receptor (EGFR) on COS7 fibroblast cells, and subsequent correlative light- and electron microscopy of whole cells in hydrated state. The label contained fluorescent quantum dots. The protocol can be used to study the stoichiometry of EGFR at the single molecule level.
Este protocolo descreve a rotulagem de receptor do factor de crescimento epidérmico (EGFR) em células de fibroblastos COS7, e microscopia de fluorescência correlata subseqüente e microscopia eletrônica de varredura ambiental (ESEM) de células inteiras em estado hidratado. Pontos quânticos fluorescentes (QDs) foram acoplados a EGFR por meio de um protocolo de marcação de dois passos, proporcionando uma marcação de proteínas eficiente e específico, evitando ao mesmo tempo induzida pelo rótulo agrupamento do receptor. A microscopia de fluorescência fornecida imagens visão geral dos locais celulares do EGFR. A microscopia eletrônica de transmissão de varredura (STEM) detector foi utilizado para detectar os rótulos QD com resolução nanométrica. As imagens resultantes correlativos fornecer dados da distribuição do EGFR celular, e a estequiometria, a nível molecular único no contexto natural da célula intacta hidratado. ESEM imagens de haste revelou o receptor estar presente como monómero, como homodímero, e em pequenos aglomerados. Marcando com dois QDs diferentes,isto é, um que emite a 655 nm e a 800 revelou resultados semelhantes característicos.
Uma nova abordagem foi introduzida recentemente, a células inteiras imagem com proteínas marcadas em estado líquido usando STEM 1-3, ou microscopia de fluorescência correlativa e STEM 4-7. Esta metodologia é capaz de se estudar a distribuição espacial das proteínas da membrana e complexos de proteína incluindo a sua estequiometria no nível de molécula individual nas membranas plasmáticas de células inteiras intactas. Aqui, descrevemos um protocolo envolvendo uma rotulagem específica de dois passos de proteínas receptoras com pontos quânticos fluorescentes (QDs) 8, e microscopia de luz e correlativo ESEM-STEM. Como exemplo, estudou-se a EGFR, uma proteína de membrana que pertencem à superfamília de proteínas quinase. Após a ligação ao ligando, o receptor é activado e, em seguida, forma um dímero com o EGFR outra activado; a cascata de sinal subsequente conduz a proliferação de células 9. As mutações que conduzem à expressão ou actividade anormal de EGFR desempenham um papel central em muitos tipos de cancro 10. Estudo emg o arranjo espacial deste receptor de membrana em células completas fornece informações importantes sobre a sua função de contexto e possíveis alterações dos mesmos 11-14. Mas continua a ser um desafio para investigar a distribuição de monómeros EGFR, dímeros e clusters diretamente em um (sub) nível celular com métodos convencionais de microscopia biochemical- ou 15. O nosso método é capaz de visualizar os EGFR com uma resolução espacial de poucos nanómetros de tal forma que a localização de proteínas no complexo pode ser determinada. Mais importante ainda, a informação obtida sobre a distribuição estequiométrica refere-se à situação nativa da proteína na célula intacta.
A fim de alcançar uma curta distância entre a etiqueta e o receptor, o EGFR foi marcado directamente através do seu ligando EGF, usando uma ligação biotina-estreptavidina para um QD. Esta etiqueta pode ser detectado tanto com microscopia fluorescence- e eletrônica. Temos utilizado este rótulo para a imagem latente correlativo de células COS7 emlíquido fechado em uma câmara microfluídicos anteriormente 1,16,17. No entanto, em virtude de um múltiplo de estreptavidina moléculas por QD, esta etiqueta pode induzir a aglomeração do receptor, levando a uma baixa eficiência de marcação ou experiências bastante caros, e não é possível concluir, a estequiometria da proteína sob investigação. Agrupamento receptor induzida etiqueta pode ser evitada através da utilização do procedimento de marcação de dois passos aqui apresentados, o que resulta em uma sonda compreendendo EGF biotinilado a qual apenas um quantum dot-estreptavidina (STR-QD) está acoplado. As células são primeiro incubadas com o EGF biotinilado, e em seguida fixado. O passo de fixação determina o ponto no tempo em que os processos de proteína são parados (dependendo da velocidade de fixação). STR-QD é aplicada posteriormente, a segunda etapa do protocolo de rotulagem. Clustering não ocorre desde que o movimento da membrana dinâmica das proteínas é impedida uma vez que as proteínas são fixadas. Além disso, a solução STR-QD, que é amais caro componente do ensaio, pode ser aplicado em uma baixa concentração optimizada, e este segundo passo de rotulagem não é tempo-fundamental, ou seja, o QD pode ser acoplado em vários minutos.
Para estudar a estequiometria de EGFR como distribuídas em células inteiras, as amostras celulares foram preparadas em microchips de silício 18. Depois de aplicar a rotulagem QD em duas etapas, e a gravação das imagens de microscopia de fluorescência, as células foram enxaguadas com água pura, e fotografada em estado hidratado usando ESEM-STEM 19. As imagens resultantes correlativas fornecem informações sobre a distribuição celular do EGFR, e a estequiometria no seu contexto natural de células hidratadas. Um método semelhante foi utilizado para estudar proteínas HER2 em células de cancro da mama num estudo recente 7.
O estudo da distribuição espacial e estequiometria das proteínas de membrana, tais como o EGFR, em células inteiras fornece informações importantes sobre a sua função de contexto e possíveis alterações dos mesmos 11-14. É um desafio para estudar a distribuição de monómeros, dímeros e agregados directamente num nível subcelular usando métodos bioquímicos vulgarmente utilizados, para o qual a informação é perdida sobre a localização da proteína na célula ou diferenças entre as células 15. Os métodos de marcação e de microscopia descritas aqui permitem a visualização dos complexos de proteína sobre uma escala de comprimento de alguns nanómetros, de modo que a sua estequiometria podem ser estudados no contexto de células intactas, individuais 4-7. Isso não é possível com (resolução super) microscopia de luz 23 porque sua resolução é insuficiente para distinguir moléculas envolvidas em um complexo proteico. Förster Ressonância Energia Transferência (FRET) é uma técnica de média conjunto <sup> 24, e não necessariamente detectar os dímeros e agregados de ordem superior, como consequência do curto alcance da transferência de energia 25. Os ensaios de ligação de proximidade 26 realmente não medir distâncias e não são, portanto, capaz de distinguir entre uma região celular com uma alta densidade de proteína, inevitavelmente levando a uma série de proximidades detectados por acaso, de uma região celular com uma densidade de proteína semelhante, mas contendo proteína Complexos que exibem diferentes distâncias entre as etiquetas. A necessária alta resolução para visualizar os componentes de complexos de proteína é obtida por microscopia electrónica de transmissão (TEM). No entanto, TEM convencional de células inteiras é limitada pelo requisito de amostras finos / secções corta através da membrana de plasma 27, ou rasgando membrana do plasma ou que interrompem 28,29 resultando em pequenos pedaços de membrana formados aleatoriamente. A membrana de plasma, assim, não está representado como um todo, levando a uma faltainformação de contexto celular, possivelmente, crucial.
Outros desafios experimentais para o estudo de estequiometria de proteínas em células surgem a partir da marcação de proteínas aplicada. Comumente imunomarcação utilizados confirma a dificuldade que um-para-um entre o receptor e estequiometria etiqueta só pode ser conseguido com uma sonda monovalente; este não é o caso quando são necessários anticorpos primários e secundários. Para obter informações sobre a estequiometria da proteína, é necessário que uma sonda se liga exclusivamente a um epítopo no receptor e tem um local de ligação para uma sonda fluorescente ou um número atómico elevado nanopartícula, por outro lado. Em segundo lugar, a precisão obtida com a rotulagem anticorpo é restrito devido à sua grande tamanho 30 de a 30 nm, de modo que uma discriminação entre proteínas vizinhas individuais, homodímeros, ou aglomerados maiores não é possível, pelo menos não para os receptores da família de EGFR. Rótulos específicos muito menores são conhecidos na literatura e can ser aplicado até mesmo para a rotulagem intracelular 31, mas aqueles que não são comumente usados. O comprimento de todo o rótulo (FEG-biotina-estreptavidina-QD) é de uma dimensão similar ao EGFR, e suficientemente pequena para ser capaz de detectar o dímero. Além disso, o procedimento de marcação de duas etapas descrito evita rotulagem induzida agrupamento receptor.
O nosso método não é muito difícil, não muito mais do que a microscopia de fluorescência de proteínas marcadas. No entanto, um experimento precisa ser realizado com grande cuidado, uma vez que o número de passos e adiciona-se um erro em um dos passos pode conduzir a um fracasso completo no experimento. Manipular os microchips não é mais tedioso que a manipulação de grades TEM mas alguns chips de treinamento vazias é recomendado. ESEM-STEM de células hidratadas integrais é provavelmente o aspecto mais difícil, e requer, pelo menos, um operador qualificado e vários dias de prática, a fim de chegar a uma resolução de cerca de 3 nm, conforme necessário para visualizar as QDs. Barragem de radiaçãoidade da amostra sob investigação apresenta um risco. A pressão e a temperatura deve ser observadas com atenção para manter a camada da água. Além disso, a espessura da camada de água pode variar entre células. É aconselhável monitorizar a presença da camada de água, utilizando o detector de electrões acima do espécime gasoso, como descrito em outro lugar 6. Regiões celulares só deve ser trabalhada uma vez ou duas vezes, para evitar danos.
Uma limitação fundamental do método é que a informação de alta resolução sobre a ultraestrutura está ausente. Outras técnicas, por exemplo, crio TEM, são necessários para estudar a estrutura de proteínas, e a ultra-estrutura celular 15. Em segundo lugar, estudar a interação dinâmica de um múltiplo de proteínas em células vivas em time-lapse microscópio não é viável por conta de danos da radiação, e requer state-of-the-art microscopia de luz 23. Actualmente, o nosso método não é capaz de determinar o nível absoluto de dímeros uma vez que o Leficiência Abeling é desconhecida, mas esperamos adicionar esses dados no futuro. No entanto, é possível dizer se dímeros estão presentes ou não. A partir da literatura sabe-se, que mesmo uma eficiência de marcação cerca de 15% é suficiente para detectar dímeros com suficiente significância estatística 32.
É prontamente possível estudar outros receptores ligados à membrana através do seu ligando, por meio de fragmentos Fab de anticorpos biotinilados específicos, ou através de outras pequenas ligadores 7, utilizando o protocolo de marcação de duas etapas descrito. Uma vez que já demonstraram que duas cores diferentes (tamanhos de QDs) pode ser usado, e rotulagem de nanopartículas de ouro foi utilizado em trabalho anterior 6, parece viável para rotular várias espécies de proteína na mesma experiência. O principal desafio para o estudo da estequiometria de várias espécies de proteína é garantir uma eficiência de marcação semelhante para ambas as espécies ou, pelo menos, uma normalização da estequiometria relativa obtida no respeitoive eficiências de rotulagem. No entanto, os dois QDs diferentes utilizados neste estudo parecem não diferem muito em eficiência de marcação (ver Figuras 2 e 4). O método descrito envolvendo rotulagem de duas etapas com QDs, e microscopia de fluorescência correlativa e ESEM-STEM apresenta um método viável para estudar a complexa interação de proteínas de membrana nas membranas plasmáticas intactas de células inteiras.
The authors have nothing to disclose.
We thank E. Arzt for his support through INM, M. Koch for help with the ESEM, and DENS Solutions for providing the microchips. Research in part supported by the Leibniz Competition 2013.
Inverted fluorescence microscope | Leica | AF6000 + DMI6000B | |
ESEM | FEI Company | Quanta 400 FEG | |
Chemicals | |||
DMEM (1x) + GlutaMax + glucose + pyruvate | Gibco | 31966-021 | |
DPBS (1x) – Calcium chloride – Magnesium chlorid | Gibco | 14190-144 | |
Fetal bovine serum, Performance Plus (FBS) | Gibco | 16000-036 | |
Cellstripper | Mediatech, Inc. | 25-056 Cl | |
Water, chromasolv Plus for HPLC | Sigma-Aldrich | 34877-2.5L | |
PBS Roti-Stock 10x PBS | Carl Roth | 1058.1 | |
Ethanol, Rotisolv HPLC grade | Carl Roth | P076.2 | |
Albumin Fraction V, biotin-free (BSA) | Carl Roth | O163.2 | |
Gelatin, from cold water fish skin | Sigma-Aldrich | G7041-500G | |
Glycine | Carl Roth | T873.1 | |
shoul | Molecular Probes | E3477 | |
Sodium teraborate decahydrate | Sigma-Aldrich | S9640-500G | |
Boric acid | Sigma-Aldrich | B6768-500G | |
Qdot 655 streptavidin conjugate | Molecular Probes | Q10121MP | |
Qdot 800 streptavidin conjugate | Molecular Probes | Q10173MP | |
Materials | |||
Silicon microchips with silicon nitride membranes | DENS Solutions | Custom made | |
of 50 nm thickness and dimensions of 50 µm x 0.40 mm |