This protocol describes the labeling of epidermal growth factor receptor (EGFR) on COS7 fibroblast cells, and subsequent correlative light- and electron microscopy of whole cells in hydrated state. The label contained fluorescent quantum dots. The protocol can be used to study the stoichiometry of EGFR at the single molecule level.
이 프로토콜은 COS7 섬유 아세포에서 표피 성장 인자 수용체 (EGFR), 및 후속 상호 형광 현미경 및 수화 상태에서의 전체 셀 환경 주사 전자 현미경 (ESEM)의 표시를 설명한다. 형광 양자 도트 (양자점)이 수용체의 라벨 유도 클러스터링을 회피하면서, 효율적이고 특이 단백질 표지를 제공하는 두 단계 라벨링 프로토콜을 통해 EGFR에 결합 하였다. 형광 현미경은 EGFR의 세포 위치 관련 이미지를 제공 하였다. 주사 투과형 전자 현미경 (STEM) 검출기는 나노 크기 해상도와 QD 라벨을 검출하는데 이용되었다. 생성 된 이미지는 상호 수화 그대로 셀의 자연 컨텍스트에서 단일 분자 수준에서 세포 분포 EGFR, 및 화학 양론의 데이터를 제공한다. ESEM-STEM 이미지는 수용체가 호모 다이머로, 모노머로서 존재할 수, 소규모 클러스터에서 밝혀. 두 개의 서로 다른 양자점과 라벨 붙이기,즉, 하나는 655 nm에서 발광 800에서 유사한 특성 결과를 밝혔다.
새로운 접근 방식은 줄기 1-3, 또는 상호 형광 현미경을 사용하여 4-7 줄기 액체 상태 표시 단백질과 이미지 전체 세포에, 최근에 소개되었다. 이 방법론은 막 단백질 및 세포의 전체적인 본래 세포막의 단일 분자 레벨에서 그들의 화학량 포함한 단백질 복합체의 공간 분포를 연구 할 수있다. 여기서는 형광 양자점 (양자점)와 수용체 단백질의 두 단계를 포함하는 특정 프로토콜 라벨 (8)과 상호 광 현미경 ESEM-STEM을 설명한다. 예를 들어, 우리는 EGFR, 단백질 키나제 상과에 속하는 세포막 단백질을 연구 하였다. 리간드가 결합하면, 수용체는 활성화하고 다른 EGFR 활성화와 이합체를 형성한다; 후속 신호 캐스케이드 세포 증식 (9)를 구동한다. 비정상적인 EGFR 발현 또는 활성 선도 돌연변이는 암 (10)의 여러 종류의 중심 역할을 담당한다. 나머지 공부G 전체 세포에서이 막 수용체의 공간 배치는 그 기능과 11-14 이들의 가능한 변화에 대한 중요한 상황에 맞는 정보를 제공합니다. 그러나 종래의 직접 biochemical- 또는 현미경 법 (15) (서브 -) 세포 수준에서 EGFR 모노머, 다이머, 및 클러스터의 분포를 조사하기 어려운 남아있다. 우리의 방법은 복합 단백질의 위치를 판별 할 수 있도록 몇 나노 미터의 공간 해상도로 EGFR을 시각화 할 수있다. 가장 중요하게는, 화학량 론적 분포에 대한 정보를 획득 그대로 세포에서 단백질의 고유의 상황에 관한 것이다.
라벨과 수용체 사이의 짧은 거리를 달성하기 위해, EGFR 직접 QD에 비오틴 – 스트렙 타비 딘을 결합하여, 그 리간드 EGF로 표지 하였다. 이 레이블은 fluorescence- 및 전자 현미경을 모두 검출 할 수있다. 우리는 COS7 세포의 상호 이미지에이 라벨을 사용했다미세 유체 챔버 이전 1,16,17 안에 액체. 그러나, QD 당 분자를 스트렙 타비 딘 복수의 계정에,이 라벨은 낮은 표지 효율 또는 다소 비싼 실험 선도 수용체 클러스터링을 야기 할 수 있으며 조사 중에 단백질의 화학 양론에 체결하는 것은 불가능하다. 라벨 유도 수용체 클러스터링은 단지 하나의 스트렙 타비 딘 – 양자점 (STR-QD)가 결합되는 바이오틴 EGF를 포함하는 조사 결과, 여기에 제시된 두 단계 라벨링 절차를 이용하여 완전히 회피 할 수있다. 세포는 제 바이오틴 EGF와 함께 배양 한 후 고정한다. 정착 단계는 단백질 프로세스 (정착 속도에 따라) 정지하는 시점을 결정한다. STR-QD는 라벨 프로토콜의 두 번째 단계 이후에 적용된다. 단백질이 고정되면 단백질의 동적 막 운동을 방해하기 때문에 클러스터링은 발생하지 않습니다. 또한, STR-QD 용액, 이는실험의 가장 비싼 구성 요소는, 최적화 된 낮은 농도로 적용될 수 있고, 표지의 두 번째 단계, 즉, 몇 분 QD로 결합 될 수 있고, 시간이 중요하지 않다.
전체 세포에 분포로 EGFR의 화학 양론을 연구하기 위해, 세포 샘플은 실리콘 마이크로 칩 (18)에 제조 하였다. 두 단계 QD 표지 및 형광 현미경 화상의 기록을 적용한 후, 세포를 순수로 세정하고, ESEM-STEM (19)를 사용하여 수화 상태에 이미징. 생성 된 이미지는 상호 수화 세포의 자연적인 상황에서 EGFR 세포 분포, 및 화학 양론에 대한 정보를 제공한다. 유사한 방법은 최근 연구 7 유방암 세포에서 HER2 단백질을 연구하기 위해 사용되었다.
전체 세포와 같은 EGFR과 막 단백질의 공간적 분포 및 화학 양론을 공부하는 것은 그 기능과 11-14 이들의 가능한 변화에 대한 중요한 상황에 맞는 정보를 제공합니다. 이 정보는 직접 또는 전지 셀 (15) 간의 차이는 단백질의 위치 파악에 대해 손실되는 일반적으로 사용되는 생화학 적 방법을 이용하여 세포 내 수준의 단량체, 이합체, 및 클러스터의 분포를 연구하기 위해 도전. 그 화학량 개별 그대로 셀 4-7의 컨텍스트 내에서 연구 할 수 있도록 여기에 기재된 라벨과 현미경 방법은 몇 나노 미터 길이 규모 단백질 복합체의 시각화를 허용한다. 이것은 (슈퍼 해상도) 광학 현미경 (23)의 해상도는 단백질 복합체에 종사하는 분자를 구별하기에 충분하기 때문에 불가능합니다. 포스터 공명 에너지 전달 (FRET)는 앙상블 평균 기법 <이다24> SUP, 반드시 에너지 전달 (25)의 근거리의 결과로서 다이머 및 고차 클러스터를 인식하지 않는다. 근접 결찰 분석법 (26)는 실제로는 거리를 측정하지 않으며, 따라서 유사한 단백질 밀도 셀룰러 영역에서, 우연에 의해 검출 된 인접도의 숫자 선도 필연적으로 높은 단백질 농도와 셀룰러 영역을 구별하지만 단백질을 포함 할 수없는 않는다 레이블 사이에 별개의 거리를 나타내는 단지. 단백질 복합체의 성분을 시각화 할 필요는 고해상도 투과 전자 현미경 (TEM)에 의해 달성된다. 그러나, 전체 셀은 종래의 TEM 플라즈마 막 (27), 또는 세포막 리핑 통해 슬라이스 또는 임의로 형성된 막의 작은 조각 (28, 29)의 결과를 깨는 얇은 샘플 / 섹션의 요구에 의해 제한된다. 세포막 따라서 부족으로 이어지는 전체 묘화되지의 가능성이 중요한 세포 상황에 맞는 정보를 제공합니다.
세포 내 단백질의 화학량 다른 실험적 연구 과제인가 단백질 표지로부터 발생한다. 일반적으로 사용되는 immunolabeling 수용체와 레이블 사이에 일대일 화학량 만 가의 프로브로 달성 될 수있는 어려움을지지; 일차 및 이차 항체가 요구되는 경우는 그렇지 않다. 단백질 화학량 론에 대한 정보를 획득하기 위해서는 프로브가 수용체 상에 하나의 에피토프에 결합하고, 고유 형광 프로브 또는 다른 측면에 높은 원자 번호의 나노 입자에 대한 하나의 결합 부위를 갖는 것이 요구된다. 이웃 단일 단백질, 동종이 량체, 또는 더 큰 클러스터 사이의 차별이 가능하지 않을 수 있도록 둘째, 항체 – 라벨에 달성 할 수있는 정밀도는 적어도 EGFR 가족의 수용체를 들어, 30 nm의 그들의 큰 크기 (30)의 계정에 제한됩니다. 훨씬 작은 특정 레이블은 문학과 캘리포니아에 공지되어있다N 세포 내 라벨 (31)에 대해서도 적용 할 수 있지만, 사람들은 일반적으로 사용되지 않습니다. 전체 레이블 (EGF-비오틴 스트렙 타비 딘 – QD)의 길이는 EGFR과 동일한 치수이고, 충분히 작은은 이량 체를 검출 할 수 있도록. 더욱이, 설명 된 두 단계의 절차는 라벨 표지 유도 수용체 클러스터링을 피한다.
우리의 방법은 매우 어려운,별로 표지 단백질의 형광 현미경보다 더하지 않습니다. 단계의 수를 가산하고, 단계 중 하나에서 에러가 실험에서 완전한 실패로 이어질 수 있기 때문에, 실험, 신중을 실시 할 필요가있다. 마이크로 칩을 처리하는 것은 권장 TEM 그리드하지만 일부 교육 빈 칩의 처리보다 더 지루하지 않습니다. 전체 수화 세포의 ESEM-STEM은 아마 가장 어려운 측면, 그리고 양자점을 시각화하기 위해 필요에 따라 3 nm의 주위에 해상도에 도달하기 위해 적어도 숙련 된 작업자과 실천의 몇 일을 필요로한다. 방사선 댐조사에서 표본의 연령은 위험을 선물한다. 압력 및 온도는 조심스럽게 물 층을 유지하기 위해 감시한다. 또한, 수층의 두께는 셀마다 다를 수있다. 다른 곳에서 기술 된 바와 같이도 6 또한, 상기 시료 가스의 전자 검출기를 사용하여 수층의 존재를 모니터링하는 것이 바람직하다. 셀룰러 영역은 손상을 방지하기 위해 한 번 또는 두 번에 이미징되어야한다.
방법의 중요한 한계는 미세 구조에 대한 고해상도 정보가 존재하지 않는 점이다. 다른 기술들은, 예, 크라이 TEM 들어 단백질 구조 및 세포 미세 구조 (15)을 연구하기 위해 필요하다. 둘째, 시간 경과 현미경에 살고있는 세포에서 단백질의 다수의 동적 상호 작용을 연구하는 방사선 손상의 계정에 가능하지 않고, 최첨단 광학 현미경 (23)이 필요합니다. 현재, 우리의 방법은 L 이후 다이머의 절대 레벨을 판정 할 수 없다abeling 효율은 알 수 있지만, 우리는 미래에 같은 데이터를 추가 할 전망이다. 이 이합체가 존재하거나없는 경우 알려 그럼에도 불구하고 할 수있다. 문헌에서 이것은 15 % 주변에도 표지 효율이 충분한 통계적 유의성 32 량체를 검출하기에 충분히 있음을 공지한다.
그것은 특정 항체의 Fab 단편 바이오틴 통해 그들의 리간드 통해 다른 막 결합 수용체를 연구하기 쉽게 할 수있다, 또는 설명한 두 단계 라벨링 프로토콜을 사용하여 다른 작은 링커를 통해 7. 이미 양자점의 두 개의 서로 다른 색 (크기)이 사용될 수 있으며, 금 나노 입자 표지 6 일 이전에 사용한 것을 증명하고 있기 때문에, 동일한 실험의 여러 단백질 종에 라벨을 실현 가능한 것으로 보인다. 여러 단백질 종의 화학 양론의 연구를위한 중요한 과제에 대하여 얻어지는 상대적인 화학량 론의 양 정규화 종 또는 적어도 유사한 표지 효율을 보장한다표지 효율 필자. 그러나, 본 연구에서 사용 된 두 개의 다른 양자점은 (도 2 및 4 참조) 표지 효율 크게 다르지 보이지 않는다. 양자점 두 단계 라벨링 및 상호 형광 현미경 ESEM-STEM 관련된 기재된 방법은 전체 세포의 세포막 손상에 막 단백질의 복잡한 상호 작용을 연구하는 실용적인 방법을 제시한다.
The authors have nothing to disclose.
We thank E. Arzt for his support through INM, M. Koch for help with the ESEM, and DENS Solutions for providing the microchips. Research in part supported by the Leibniz Competition 2013.
Inverted fluorescence microscope | Leica | AF6000 + DMI6000B | |
ESEM | FEI Company | Quanta 400 FEG | |
Chemicals | |||
DMEM (1x) + GlutaMax + glucose + pyruvate | Gibco | 31966-021 | |
DPBS (1x) – Calcium chloride – Magnesium chlorid | Gibco | 14190-144 | |
Fetal bovine serum, Performance Plus (FBS) | Gibco | 16000-036 | |
Cellstripper | Mediatech, Inc. | 25-056 Cl | |
Water, chromasolv Plus for HPLC | Sigma-Aldrich | 34877-2.5L | |
PBS Roti-Stock 10x PBS | Carl Roth | 1058.1 | |
Ethanol, Rotisolv HPLC grade | Carl Roth | P076.2 | |
Albumin Fraction V, biotin-free (BSA) | Carl Roth | O163.2 | |
Gelatin, from cold water fish skin | Sigma-Aldrich | G7041-500G | |
Glycine | Carl Roth | T873.1 | |
shoul | Molecular Probes | E3477 | |
Sodium teraborate decahydrate | Sigma-Aldrich | S9640-500G | |
Boric acid | Sigma-Aldrich | B6768-500G | |
Qdot 655 streptavidin conjugate | Molecular Probes | Q10121MP | |
Qdot 800 streptavidin conjugate | Molecular Probes | Q10173MP | |
Materials | |||
Silicon microchips with silicon nitride membranes | DENS Solutions | Custom made | |
of 50 nm thickness and dimensions of 50 µm x 0.40 mm |