This protocol describes the labeling of epidermal growth factor receptor (EGFR) on COS7 fibroblast cells, and subsequent correlative light- and electron microscopy of whole cells in hydrated state. The label contained fluorescent quantum dots. The protocol can be used to study the stoichiometry of EGFR at the single molecule level.
Dieses Protokoll beschreibt die Markierung des epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor (EGFR) auf COS7-Fibroblastenzellen und anschließende korrelativen Fluoreszenzmikroskopie und Environmental Scanning-Elektronenmikroskopie (ESEM) von ganzen Zellen in hydratisiertem Zustand. Fluoreszenzquantenpunkten (QD) wurden über eine zweistufige Markierungsprotokoll an EGFR gekoppelt und stellt eine effiziente und spezifische Markierung von Proteinen, unter Vermeidung Etikett induzierten Clustering des Rezeptors. Fluoreszenzmikroskopie zur Verfügung gestellt Übersichtsbilder der zellulären Stellen des EGFR. Die Rastertransmissionselektronenmikroskop (STEM) Detektor wurde verwendet, um die QD-Etiketten mit nanoskaliger Auflösung zu erfassen. Die erhaltenen korrelativen Bilder liefern Daten des zellulären EGFR Verteilung und der Stöchiometrie auf der Einzelmolekülebene in der natürlichen Umgebung des hydratisierten intakte Zelle. ESEM-STEM-Bilder zeigten der Rezeptor als Monomer vorliegen, wie Homodimer und in kleinen Clustern. Markierung mit zwei verschiedenen QDs,dh eine Emission bei 655 nm und bei 800 offenbart ähnliche Charakteristik Ergebnisse.
Ein neuer Ansatz wurde vor kurzem mit markierten Proteinen in flüssigem Zustand unter Verwendung von STEM 1-3 oder korrelative Fluoreszenzmikroskopie und STEM 4-7 eingeführt, die dem Bild mit ganzen Zellen. Diese Methode ist in der Lage, die räumliche Verteilung der Membranproteine und Proteinkomplexen einschließlich ihrer Stöchiometrie auf der Einzelmolekülebene in den intakten Plasmamembranen von ganzen Zellen. Hier beschreiben wir ein Protokoll mit einen zweistufigen spezifische Markierung von Rezeptorproteinen mit Fluoreszenzquantenpunkten (QDs) 8 und korrelativen Lichtmikroskopie und ESEM-STEM. Als Beispiel untersuchten wir die EGFR, ein Membranprotein, das an die Proteinkinase-Superfamilie gehört. Nach Ligandenbindung aktiviert und dann der Rezeptor bildet ein Dimer mit einem anderen aktivierten EGFR; die nachfolgende Signalkaskade treibt Zellproliferation 9. Mutationen, die zu abnormalen EGFR-Expression oder -Aktivität spielen eine zentrale Rolle in vielen Arten von Krebs 10. Studying die räumliche Anordnung dieser Membranrezeptor in ganzen Zellen wichtige Kontextinformation über seine Funktion und deren eventuellen Änderungen 11-14. Aber es bleibt schwierig, die Verteilung der EGFR Monomere, Dimere und Cluster direkt auf einem (Teil-) zellulärer Ebene mit biochemical- oder konventionellen Mikroskopieverfahren 15 zu sondieren. Unsere Methode ist in der Lage, zu visualisieren EGFRs mit einer räumlichen Auflösung von wenigen Nanometern, so dass die Positionen von Proteinen, in einem Komplex bestimmt werden kann. Am wichtigsten ist, bezieht sich die erhaltenen Informationen zu dem stöchiometrischen Verteilung zum nativen Zustand des Proteins in der intakten Zelle.
Um eine kurze Strecke zwischen dem Etikett und dem Rezeptor zu erreichen, wurde EGFR direkt über seinem Liganden EGF bezeichnet, mit einer Biotin-Streptavidin-Bindung zu einem QD. Dieses Label kann sowohl mit Fluoreszenz- und Elektronenmikroskopie nachgewiesen werden. Wir haben dieses Label für korrelative Bildgebung von COS7-Zellen in verwendetFlüssigkeit in einem mikrofluidischen Kammer zuvor 1,16,17 umschlossen. Jedoch aufgrund eines Vielfachen von Streptavidin-Molekülen pro QD, kann das Etikett im Rezeptoraggregation induzieren, was zu einer geringen Markierungsausbeute oder eher teuer Experimenten und es ist nicht möglich, auf die Stöchiometrie der untersuchten Proteins schließen. Etikett induzierten Rezeptorclusterbildung ganz durch den Einsatz der hier dargestellten zweistufigen Markierungsverfahren, was zu einer Sonde, umfassend biotinylierten EGF, denen nur ein Streptavidin-Quantenpunkt (STR-QD) angekoppelt ist vermieden. Die Zellen werden zuerst mit biotinyliertem EGF inkubiert und dann fixiert. Der Fixierungsschritt bestimmt den Zeitpunkt, zu dem Protein Prozesse werden gestoppt (in Abhängigkeit von der Geschwindigkeit der Fixierung). STR-QD wird anschließend als zweiten Schritt der Markierungsprotokoll angewendet. Clustering nicht stattfindet, da dynamischen Membranbewegung der Proteine behindert wird, wenn die Proteine befestigt sind. Darüber hinaus ist die STR-QD-Lösung, die dieteuerste Komponente des Experiments sich in optimierter geringer Konzentration angewendet werden, und dieser zweite Schritt der Etikettierung ist es zeitlich nicht entscheidend, dh die QD in einigen Minuten angekoppelt werden.
Die Stöchiometrie von EGFR zu untersuchen, wie in ganzen Zellen verteilt waren zelluläre Proben auf Silicium-Mikrochips 18 vorbereitet. Nach dem Aufbringen des zweistufigen QD Kennzeichnung sowie die Aufzeichnung der Fluoreszenzmikroskopiebilder wurden die Zellen mit reinem Wasser gespült und in hydratisiertem Zustand unter Verwendung von ESEM-STEM 19 abgebildet. Die resultierenden Korrelations Bilder geben Auskunft über die zellulären EGFR Verteilung und der Stöchiometrie in ihrem natürlichen Kontext der hydratisierten Zellen. Ein ähnliches Verfahren wurde verwendet, um Proteine HER2 in Brustkrebszellen in einer aktuellen Studie 7 studieren.
, Die räumliche Verteilung und die Stöchiometrie der Membranproteine, wie beispielsweise die EGFR, in ganzen Zellen wichtige Kontextinformation über seine Funktion und deren eventuellen Änderungen 11-14. Es wird schwierig, die Verteilung der Monomere, Dimere und Cluster direkt auf einem subzellulärer Ebene mit gängigen biochemischen Verfahren, für die Informationen über die Lokalisierung des Proteins in der Zelle oder Unterschiede zwischen den Zellen 15 verloren studieren. Die hier beschriebenen Etikettierung und Mikroskopieverfahren erlauben die Sichtbarmachung von Proteinkomplexen auf einer Längenskala von wenigen Nanometern, so daß seine Stöchiometrie kann im Rahmen der einzelnen, intakten Zellen 4-7 untersucht werden. Dies ist nicht mit der (Super Resolution) Lichtmikroskopie 23, weil seine Entschließung nicht ausreichend, um Moleküle in einem Proteinkomplex beschäftigt zu unterscheiden ist möglich. Förster Resonance Energy Transfer (FRET) ist ein Ensemble Mittelungstechnik <sup> 24, und nicht unbedingt die Dimere und höhere Ordnung Clustern zu erkennen als Folge der kurzen Reichweite der Energieübertragung 25. Ligationsassays 26 nicht tatsächlich Abstände zu messen und daher nicht in der Lage ist, zwischen einem zellularen Bereich mit einem hohen Proteindichte unvermeidlich, was zu einer Anzahl von detektierten Annäherungen durch Zufall aus einer zelluläre Region mit einer ähnlichen Proteindichte aber Protein enthält Komplexe unterschiedliche Abstände zwischen den Etiketten aufweisen. Die geforderte hohe Auflösung, die Bestandteile von Proteinkomplexen Visualisierung wird durch Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) erreicht. Jedoch wird die herkömmliche TEM von ganzen Zellen durch die Anforderung von dünnen Proben / Abschnitte schneiden durch die Plasmamembran 27 oder Plasmamembran Rippen oder Abbruch 28,29 was zufällig gebildeten kleinen Membranstücke beschränkt. Die Plasmamembran wird somit nicht als Ganzes abgebildet wird, was zu einem Mangelder möglicherweise entscheidenden zellulären Kontext-Informationen.
Andere experimentelle Herausforderungen für die Untersuchung von Protein-Stöchiometrie in Zellen entstehen aus der aufgetragenen Proteinmarkierung. Üblicherweise verwendeten Immunmarkierung trägt die Schwierigkeit, die eins-zu-eins-Stöchiometrie zwischen Rezeptor und Marker kann nur mit einem einwertigen Sonde erreicht werden kann; ist dies nicht der Fall, wenn primäre und sekundäre Antikörper erforderlich sind. Um Informationen über die Protein Stöchiometrie zu erhalten, ist es erforderlich, dass eine Sonde bindet eindeutig einem Epitop auf dem Rezeptor und weist eine Bindungsstelle für eine Fluoreszenzsonde oder einer hohen Ordnungszahl Nanopartikel auf der anderen Seite. Zweitens ist die Präzision erreichbar mit Antikörper-Markierung aufgrund ihrer Größe von 30 bis 30 nm beschränkt, so dass eine Unterscheidung zwischen Nachbar einzelne Proteine, Homodimere oder größere Cluster nicht möglich ist, zumindest nicht für Rezeptoren der EGFR-Familie. Viel kleineren spezifischen Etiketten werden in der Literatur und ca bekanntn auch für die intrazelluläre Markierung 31 aufgebracht werden, aber diese sind nicht häufig verwendet. Die Länge des gesamten Etiketts (EGF-Biotin-Streptavidin-QD) von ähnlicher Abmessung wie die EGFR und ausreichend klein, um das Dimer zu detektieren. Außerdem vermeidet die beschriebene zweistufige Etikettiervorgang Kennzeichnung induzierten Rezeptoraggregation.
Unsere Methode ist nicht sehr schwierig, nicht viel mehr als Fluoreszenzmikroskopie von markierten Proteinen. Jedoch benötigt ein Experiment mit großer Sorgfalt durchgeführt werden, da die Anzahl der Stufen summiert und ein Fehler in einem der Schritte können zu einem kompletten Ausfall des Experiments führt. Der Umgang mit den Mikrochips ist langweiliger als die Handhabung von TEM Grids, aber einige Trainings leere Chips wird empfohlen. ESEM-STEM ganzer hydratisierten Zellen ist wahrscheinlich der schwierigste Aspekt und erfordert mindestens eine qualifizierte Betreiber und mehrere Tage von der Praxis, um eine Auflösung von etwa 3 nm zu erreichen, wie erforderlich, um die QDs zu visualisieren. Strahlung damAlter der Probe unter Untersuchung eine Gefahr. Der Druck und die Temperatur sollte sorgfältig beobachtet, um eine Wasserschicht aufrecht zu erhalten. Darüber hinaus kann die Dicke der Wasserschicht zwischen den Zellen variieren. Es ist ratsam, die Anwesenheit der Wasserschicht unter Verwendung des gasförmigen Elektronendetektor über die Probe zu überwachen, wie auch anderswo. 6 beschrieben Zelluläre Regionen sollten nur einmal oder zweimal abgebildet werden, um Schäden zu vermeiden.
Eine Haupteinschränkung des Verfahrens besteht darin, dass hochauflösende Information über die Ultrastruktur fehlt. Andere Techniken, zum Beispiel Cryo TEM, werden benötigt, um die Proteinstruktur und der zellulären Ultrastruktur 15 zu studieren. Zweitens die Untersuchung der dynamischen Zusammenspiel von einem Vielfachen von Proteinen in lebenden Zellen in Zeitraffer-Mikroskop nicht möglich ist aufgrund von Strahlenschäden und erfordert state-of-the-Art-Lichtmikroskopie 23. Derzeit ist unser Verfahren nicht in der Lage, die Bestimmung der absoluten Höhe der Dimere seit dem lAbeling Effizienz ist unbekannt, aber wir erwarten, dass diese Daten in Zukunft hinzuzufügen. Dennoch ist es möglich, zu sagen, ob Dimere vorhanden sind oder nicht. Aus der Literatur ist bekannt, dass sogar ein Markierungseffizienz etwa 15% reicht aus, um Dimere mit ausreichender statistischer Signifikanz 32 zu erkennen.
Es ist ohne weiteres möglich, andere membrangebundene Rezeptoren über ihre Liganden zu untersuchen, über biotinylierten Fab-Fragmenten von Antikörpern oder über andere kleine Linker 7 unter Verwendung des beschriebenen zweistufigen Markierungsprotokoll. Da wir bereits gezeigt, dass zwei verschiedene Farben (Größen) der QDs verwendet werden kann, und Gold-Nanopartikel-Markierung wurde in früheren Arbeiten 6 verwendet, so scheint es möglich, mehrere Proteinspezies im gleichen Experiment zu beschriften. Die größte Herausforderung für die Untersuchung der Stöchiometrie von mehreren Proteinspezies ist die Gewährleistung einer ähnlichen Markierungseffizienz für beide Spezies oder zumindest eine Normalisierung der erhaltenen relativen Stöchiometrie auf der Achtungive Kennzeichnung Wirkungsgrade. Dennoch unterscheiden sich die beiden unterschiedlichen QD in dieser Studie verwendet scheinen nicht sehr verschieden in Markierungseffizienz (siehe 2 und 4). Das beschriebene Verfahren, das Zwei-Schritt-Markierung mit QDs und korrelative Fluoreszenzmikroskopie und ESEM-STEM stellt eine praktikable Methode, um das komplexe Zusammenspiel von Membranproteinen in den intakten Plasmamembranen von ganzen Zellen zu studieren.
The authors have nothing to disclose.
We thank E. Arzt for his support through INM, M. Koch for help with the ESEM, and DENS Solutions for providing the microchips. Research in part supported by the Leibniz Competition 2013.
Inverted fluorescence microscope | Leica | AF6000 + DMI6000B | |
ESEM | FEI Company | Quanta 400 FEG | |
Chemicals | |||
DMEM (1x) + GlutaMax + glucose + pyruvate | Gibco | 31966-021 | |
DPBS (1x) – Calcium chloride – Magnesium chlorid | Gibco | 14190-144 | |
Fetal bovine serum, Performance Plus (FBS) | Gibco | 16000-036 | |
Cellstripper | Mediatech, Inc. | 25-056 Cl | |
Water, chromasolv Plus for HPLC | Sigma-Aldrich | 34877-2.5L | |
PBS Roti-Stock 10x PBS | Carl Roth | 1058.1 | |
Ethanol, Rotisolv HPLC grade | Carl Roth | P076.2 | |
Albumin Fraction V, biotin-free (BSA) | Carl Roth | O163.2 | |
Gelatin, from cold water fish skin | Sigma-Aldrich | G7041-500G | |
Glycine | Carl Roth | T873.1 | |
shoul | Molecular Probes | E3477 | |
Sodium teraborate decahydrate | Sigma-Aldrich | S9640-500G | |
Boric acid | Sigma-Aldrich | B6768-500G | |
Qdot 655 streptavidin conjugate | Molecular Probes | Q10121MP | |
Qdot 800 streptavidin conjugate | Molecular Probes | Q10173MP | |
Materials | |||
Silicon microchips with silicon nitride membranes | DENS Solutions | Custom made | |
of 50 nm thickness and dimensions of 50 µm x 0.40 mm |