This protocol describes the labeling of epidermal growth factor receptor (EGFR) on COS7 fibroblast cells, and subsequent correlative light- and electron microscopy of whole cells in hydrated state. The label contained fluorescent quantum dots. The protocol can be used to study the stoichiometry of EGFR at the single molecule level.
Bu protokol, COS7 fibroblast hücreleri üzerinde epidermal büyüme faktörü reseptörü (EGFR), ve daha sonra bağıntılı, flüoresans mikroskopisi ve hidre edilmiş halde, tüm hücrelerin taramalı elektron mikroskopisi (ESEM) etiketleme tarif eder. Floresan kuantum noktaları (QDS) reseptörünün bir etiket ile indüklenen kümeleme kaçınarak, etkin ve spesifik protein etiketleme sağlayan iki aşamalı bir etiketleme protokolü üzerinden EGFR birleştirilmiştir. Floresan mikroskopi EGFR hücre yerle genel görüntüsünü sağladı. Taramalı transmisyon elektron mikroskobu (STEM) dedektörü nano çözünürlükte QD etiketleri tespit etmek için kullanılmıştır. Elde edilen bağıntılı görüntüleri hidratlı bozulmamış hücrenin doğal bağlamında tek moleküler düzeyde hücresel EGFR dağıtımı ve stokiyometri veri sağlar. ESEM-KÖK görüntüleri reseptör homodimer olarak, monomer olarak mevcut olabilir ve küçük kümelerde ortaya koymuştur. İki farklı QDS Etiketleme,yani, bir 655 nm yayan ve 800 benzer karakteristik sonuçlar ortaya koydu.
Yeni bir yaklaşım STEM 1-3 veya bağlaşık floresan mikroskobu kullanarak ve 4-7 STEM sıvı halde etiketlenmiş proteinler ile görüntü tüm hücrelere, son zamanlarda tanıtıldı. Bu metodoloji, zar proteinleri ve bütün hücrelerin dokunulmamış plazma membranlarında tek bir molekül düzeyde stokiyometri de dahil olmak üzere protein kompleksleri uzamsal dağılımını incelemek yeteneğine sahiptir. Burada, bir floresan kuantum noktaları (QDS) reseptör proteinlerinin iki aşamalı bir özel etiketleme içeren protokol 8 ve bağlaşık ışık mikroskopisi ve ESEM sap tarif eder. Örnek olarak, EGFR, protein kinaz süper ailesine ait olan bir zar proteini incelenmiştir. Ligand bağlanma üzerine, alıcı aktive eder ve daha sonra başka bir aktive edilmiş EGFR ile birlikte bir dimer meydana getirir; daha sonra sinyal kaskadı hücre çoğalmasını 9 hareket ettirir. Anormal EGFR ekspresyonu veya aktivitesine yol açan mutasyonlar kanser 10 birçok çeşit merkezi bir rol oynamaktadır. Okuyorg Bütün hücrelerde bu membran reseptörü mekansal düzenleme işlevi ve 11-14 bunların olası değişikliklerle ilgili önemli bağlam bilgi sağlar. Ama doğrudan biochemical- veya geleneksel mikroskop yöntemleriyle 15 ile (alt) hücresel seviyede EGFR monomerlerin, dimerlerin ve kümelerin dağılımını araştırmak için zorlu kalır. Önerilen yöntem, bir kompleks içinde proteinlerin yer tespit edilebilir şekilde birkaç nanometre uzamsal çözünürlüğe sahip EGFR görselleştirme yeteneğine sahiptir. Daha da önemlisi, stoikiometrik dağılımı hakkında bilgi elde edilen sağlam hücre proteinin nativ durum ile de ilgilidir.
Etiket ve reseptörü arasında kısa bir mesafe elde etmek için, EGFR doğrudan QD bir biyotin-streptavidin bağı ile, ligandı EGF ile etiketlenmiştir. Bu etiket Floresan-ve elektron mikroskopi ile her iki tespit edilebilir. Biz COS7 hücrelerinin bağıntılı görüntülemede bu etiketi kullanmışmikroakışkan bölme daha önceden 1,16,17 içine sıvı. Ancak, QD başına molekülleri streptavidin katları nedeniyle, bu etiketin düşük etiketleme verimliliği ya da oldukça pahalı deneylere lider, reseptör kümeleme neden olabilir ve bu soruşturma kapsamında protein stokiyometri sonucuna varılması mümkün değildir. Etiket uyarılmış reseptör kümelenme olan tek streptavidin kuantum dot (STR-QD) bağlanmış olduğu, biyotinile edilmiş EGF içeren bir prob ile sonuçlanan, burada sunulan iki adımlı etiketleme prosedürü kullanılarak tamamen önlenebilir. Hücreler ilk olarak biyotinile EGF ile kuluçkalanmıştır, ve daha sonra sabitlenir. Sabitleme aşaması protein işlemleri (tespitin hızına bağlı olarak) durduğu zaman noktasını belirler. STR-QD etiketleme protokolünün ikinci adımında, bundan sonra uygulanır. Proteinler sabit kez proteinlerin dinamik membran hareketi engellenmiş olduğundan Kümelenme yer almaz. Ayrıca, STR-QD çözeltisi, ki buDeneyin en pahalı bileşeni, optimize edilmiş bir düşük konsantrasyonda uygulanabilir ve etiketleme bu ikinci aşama, yani, QD birkaç dakika bağlanmış olabilir, zaman önemli değildir.
Bütün hücrelerde dağıtılmış olarak EGFR stokiyometri incelemek için, hücre örnekleri, silikon mikroçip 18 ile hazırlanmıştır. Iki aşamalı bir QD etiketleme ve floresan mikroskobu görüntü kayıt uygulandıktan sonra, hücreler, saf su ile durulanmış ve ESEM-STEM 19 ile hidratlanmış halde görüntüsü alınmıştır. Elde edilen bağıntılı görüntüler hidratlı hücrelerin doğal bağlamında hücresel EGFR dağılımı ve stokiyometri hakkında bilgi verir. Benzer bir yöntem Yeni bir çalışmada 7 göğüs kanseri hücrelerinin HER2 proteini incelemek için kullanılmıştır.
Bütün hücrelerde EGFR gibi membran proteinleri, uzamsal dağılım ve stokiometrinin incelenmesi işlevi ve 11-14 bunların olası değişiklikler hakkında önemli içerik bilgilerini sağlar. Doğrudan bilgi hücre veya hücreler 15 arasındaki farklılıkların protein lokalizasyonu ile ilgili kayıp olduğu için yaygın olarak kullanılan biyokimyasal yöntemlerle bir hücre içi seviyesinin üzerinde monomerlerin, dimerlerin ve kümelerin dağılımını incelemek için zordur. Bunu stokiyometri birey, sağlam hücreler 4-7 kapsamında ele böylece burada açıklanan etiketleme ve mikroskopi yöntemleri, birkaç nanometre uzunluğu ölçekte protein kompleksleri görünümlerini verir. Bu (süper çözünürlük) ışık mikroskobu 23 çözünürlüğü bir protein kompleksi yapan moleküllerin ayırt yetersiz olduğundan mümkün değildir. Förster Rezonans Enerji Transferi (FRET) bir topluluk ortalama tekniği <olduğunu24> sup ve mutlaka enerji transferi 25 kısa menzilli bir sonucu olarak dimerleri ve daha yüksek mertebeden kümelerini algılamaz. Proksimite ligasyonu deneyleri 26 aslında mesafeleri ölçmek ve bundan dolayı benzer bir protein yoğunluğuna sahip bir selüler bölgeden, rasgele şansa tespit yakınlıklarına bir dizi gelen kaçınılmaz olarak, yüksek protein yoğunluğuna sahip bir selüler bölgesi arasında ayrım, ancak protein içeren yeteneğine sahip değildirler etiketler arasında belirgin mesafeler sergileyen kompleksleri. Protein kompleksleri bileşenleri görselleştirmek için gerekli olan yüksek çözünürlüklü transmisyon elektron mikroskobu (TEM) ile elde edilir. Bununla birlikte, bütün hücreler, geleneksel TEM plazma membranı 27 ya da plazma zarı kopyalama yoluyla dilimleme veya membranın rastgele oluşturulmuş küçük parçalar halinde elde edilen 28,29 kopma ince örnekleri / kesitlerin şartı ile sınırlıdır. Plazma membranı böylece eksikliği gelen bir bütün olarak görüntülü değildirmuhtemelen önemli hücresel kapsam bilgisi.
Hücrelerde protein stoikiometrinin çalışma için diğer deneysel zorluklar uygulamalı protein etiketleme kaynaklanmaktadır. Yaygın olarak kullanılan immün reseptörü ve etiket arasındaki bire bir stoikiometri yalnızca monovalent sonda ile elde edilebilir zorluk taşımaktadır; birincil ve ikincil antikorlar gerekmektedir, bu durum böyle değildir. Protein stokiyometri ile ilgili bilgiler elde etmek için, bir prob reseptörü üzerindeki bir epitopa bağlanır ve benzersiz bir flüoresan sonda veya diğer tarafta bir yüksek atomik sayılı, nano bir bağlanma sahasına sahiptir gerekmektedir. Komşu bir protein, homodimerler ya da daha büyük kümeler arasında bir ayrım mümkün değildir, böylece İkinci olarak, antikor etiketleme ile elde hassas en azından EGFR ailesi reseptörleri için, 30 nm büyük boyutları 30 nedeniyle sınırlıdır. Çok küçük spesifik etiketleri edebiyat ve ca bilinmektedirn, hücre içi etiketleme 31 için daha uygulanabilir, ancak bu genel olarak kullanılmamaktadır. Bütün etiket (EGF-biyotin-streptavidin QD) uzunluğu EGFR gibi benzer bir boyuta sahiptir ve yeterince küçük bir dimeri tespit edebilecektir. Ayrıca, tarif edilen iki adımlı etiketleme prosedürü markalama uyarılmış reseptör kümeleme önler.
Önerilen yöntem, çok zordur, fazla etiketli proteinlerin floresan mikroskobu daha fazla değildir. Adım sayısı kadar ekler ve aşamalarından birinde bir hata deneyde bir arızaya yol açabilir Bununla birlikte, bir deney, büyük bir dikkatle yürütülen gerekmektedir. Mikroçipler İşleme tavsiye edilir TEM ızgaraları ancak bazı eğitim, boş cips işleme daha sıkıcı değil. Bütün sulu hücrelerin ESEM-STEM muhtemelen en zor olan ve QDS görselleştirmek için gerektiği gibi 3 nm civarında bir çözüme ulaşmak için, en azından bir uzman operatör ve uygulama birkaç gün gerektirir. Radyasyon barajSoruşturma kapsamında numune yaşı bir risk sunar. Basınç ve sıcaklık dikkatli bir şekilde bir su tabakasının muhafaza edilmesi dikkat edilmelidir. Ayrıca, su tabakasının kalınlığı, hücreler arasında değişebilir. Başka bir yerde tarif edildiği gibi, 6 Bu örnek yukarıdaki gaz halindeki elektron dedektörü ile su tabakasının varlığını tespit için tavsiye edilir. Hücresel bölgeler sadece zarar görmemesi için bir veya iki kez görüntülü olmalıdır.
Yöntemin bir önemli sınırlaması ultrastrüktürü ile ilgili yüksek çözünürlüklü bilgi yoktur olmasıdır. Diğer teknikler, örneğin, kriyo TEM için, protein yapısı ve hücresel ultrastrüktürel 15 çalışma için ihtiyaç vardır. İkincisi, zaman atlamalı mikroskobu canlı hücrede protein katları dinamik etkileşimi okuyan radyasyon hasarı nedeniyle mümkün değildir ve state-of-the-art ışık mikroskobu 23 gerektirir. Şu anda, bizim yöntemi l yana dimerlerin mutlak seviyesinin belirlenmesi yeteneğine sahip değildirAbeling verimliliği bilinmiyor ancak gelecekte bu tür veri eklemek için bekliyoruz. Bu dimerleri mevcut veya değilse söylemek yine de mümkün. Literatürde itibaren% 15 civarında hatta bir etiketleme verimliliği yeterli istatistiksel anlamlılık 32 dimerlerini algılamak için yeterli olduğunu bilinmektedir.
Bu özel antikorların biyotinile Fab fragmanları ile, bunların ligand yoluyla diğer zara bağlı reseptörleri çalışma kolaylıkla mümkündür, ya da tarif edilen iki adımlı etiketleme protokolü kullanarak diğer küçük bağlayıcılar 7 ile. Daha önce QDS iki farklı renk (boyutlar) kullanılabilir, ve altın nanoparçacık markalama önceki çalışma 6 kullanılmıştır olduğunu göstermiştir beri, aynı deneyde birden fazla protein türü etiketlemek için uygun görünmektedir. Birden fazla protein türlerinin stoykiyometrisini çalışması için temel zorluk saygı elde edilen göreli stokiyometriye bir normalleşme her iki tür için ya da en azından benzer bir etiketleme verimliliği sağlamaktıretiketleme verimliliği ive. Bununla birlikte, bu çalışmada kullanılan iki farklı QDS (Şekil 2 ve 4) işaretleme verimliliğine çok farklı görünmemektedir. QDS iki aşamalı etiketleme ve bağlaşık floresan mikroskobu ve ESEM-STEM kapsayan anlatılan yöntem bütün hücrelerin sağlam plazma zarlarında membran proteinlerinin karmaşık etkileşimi incelemek için uygulanabilir bir yöntem sunar.
The authors have nothing to disclose.
We thank E. Arzt for his support through INM, M. Koch for help with the ESEM, and DENS Solutions for providing the microchips. Research in part supported by the Leibniz Competition 2013.
Inverted fluorescence microscope | Leica | AF6000 + DMI6000B | |
ESEM | FEI Company | Quanta 400 FEG | |
Chemicals | |||
DMEM (1x) + GlutaMax + glucose + pyruvate | Gibco | 31966-021 | |
DPBS (1x) – Calcium chloride – Magnesium chlorid | Gibco | 14190-144 | |
Fetal bovine serum, Performance Plus (FBS) | Gibco | 16000-036 | |
Cellstripper | Mediatech, Inc. | 25-056 Cl | |
Water, chromasolv Plus for HPLC | Sigma-Aldrich | 34877-2.5L | |
PBS Roti-Stock 10x PBS | Carl Roth | 1058.1 | |
Ethanol, Rotisolv HPLC grade | Carl Roth | P076.2 | |
Albumin Fraction V, biotin-free (BSA) | Carl Roth | O163.2 | |
Gelatin, from cold water fish skin | Sigma-Aldrich | G7041-500G | |
Glycine | Carl Roth | T873.1 | |
shoul | Molecular Probes | E3477 | |
Sodium teraborate decahydrate | Sigma-Aldrich | S9640-500G | |
Boric acid | Sigma-Aldrich | B6768-500G | |
Qdot 655 streptavidin conjugate | Molecular Probes | Q10121MP | |
Qdot 800 streptavidin conjugate | Molecular Probes | Q10173MP | |
Materials | |||
Silicon microchips with silicon nitride membranes | DENS Solutions | Custom made | |
of 50 nm thickness and dimensions of 50 µm x 0.40 mm |