El estudio de la estequiometría de factor de crecimiento epidérmico en células intactas utilizando microscopía correlativa

Summary

This protocol describes the labeling of epidermal growth factor receptor (EGFR) on COS7 fibroblast cells, and subsequent correlative light- and electron microscopy of whole cells in hydrated state. The label contained fluorescent quantum dots. The protocol can be used to study the stoichiometry of EGFR at the single molecule level.

Abstract

Este protocolo describe el etiquetado del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) en las células de fibroblastos COS7, y la posterior microscopía de fluorescencia y microscopía correlativa electrónico de barrido ambiental (ESEM) de células enteras en estado hidratado. Puntos cuánticos fluorescentes (QDs) se acoplaron a EGFR a través de un protocolo de etiquetado de dos pasos, proporcionando un etiquetado proteína eficiente y específica, evitando al mismo tiempo la agrupación inducida etiqueta del receptor. Microscopía de fluorescencia proporciona imágenes visión general de las localizaciones celulares del EGFR. La microscopía electrónica de transmisión de barrido (STEM) detector se utilizó para detectar las etiquetas QD con una resolución de escala nanométrica. Las imágenes resultantes proporcionan los datos correlativos de la distribución EGFR celular, y la estequiometría a nivel molecular única en el contexto natural de la célula intacta hidratado. Imágenes ESEM-STEM revelaron el receptor esté presente como monómero, como homodímero, y en pequeños grupos. Etiquetado con dos puntos cuánticos diferentes,es decir, uno que emite a 655 nm ya 800 revelado resultados característicos similares.

Introduction

Un nuevo enfoque se ha introducido recientemente, a las células enteras de imagen con proteínas marcadas en estado líquido mediante STEM ^1-3, o microscopía de fluorescencia correlativa y STEM ^4-7. Esta metodología es capaz de estudiar la distribución espacial de las proteínas de membrana y complejos de proteínas incluyendo su estequiometría a nivel de una sola molécula en las membranas plasmáticas de células enteras intactas. Aquí se describe un protocolo que implica un etiquetado específico en dos etapas de las proteínas del receptor con puntos cuánticos fluorescentes (puntos cuánticos) ^8, y la microscopía de luz correlativa y ESEM-STEM. Como ejemplo, se estudió el EGFR, una proteína de membrana que pertenece a la superfamilia de la proteína quinasa. Tras la unión del ligando, el receptor se activa y luego forma un dímero con otra EGFR activado; la cascada de señales posterior impulsa la proliferación celular ^9. Las mutaciones que conducen a la expresión de EGFR o actividad anormal juegan un papel central en muchos tipos de cáncer ^10. Estudiar eng la disposición espacial de este receptor de membrana en células enteras proporciona información de contexto importante acerca de su función y posibles cambios de los mismos ^11-14. Pero sigue siendo un reto para investigar la distribución de los monómeros, dímeros EGFR, y racimos directamente en una (sub) nivel celular con métodos de microscopía biochemical- o convencionales ^15. Nuestro método es capaz de visualizar EGFR con una resolución espacial de unos pocos nanómetros tales que las ubicaciones de las proteínas en un complejo se puede determinar. Lo más importante, la información obtenida acerca de la distribución estequiométrica se refiere a la situación nativa de la proteína en la célula intacta.

Con el fin de lograr una corta distancia entre la etiqueta y el receptor, EGFR fue etiquetado directamente a través de su ligando EGF, utilizando un enlace biotina-estreptavidina a un QD. Esta etiqueta se puede detectar tanto con microscopía por fluorescencia y de electrones. Hemos utilizado esta etiqueta para imágenes correlativa de las células COS7 enlíquido encerrado en una cámara de microfluidos previamente ^1,16,17. Sin embargo, a causa de un múltiplo de estreptavidina moléculas por QD, esta etiqueta puede inducir la agrupación de receptores, lo que lleva a una eficiencia baja o etiquetado experimentos bastante caros, y no es posible concluir sobre la estequiometría de la proteína bajo investigación. Etiqueta de la agrupación de receptores inducida puede evitarse por completo mediante el empleo del procedimiento de marcaje de dos pasos que aquí se presenta, dando como resultado una sonda que comprende EGF biotinilado al que se acopla sólo un estreptavidina puntos cuánticos (QD-STR). Las células se incubaron con EGF primera biotinilado, y después se fijaron. La etapa de fijación determina el punto de tiempo en el que se detienen los procesos de proteína (dependiendo de la velocidad de la fijación). STR-QD se aplica a partir de entonces como segundo paso del protocolo de marcaje. La agrupación no tiene lugar desde el movimiento de la membrana dinámica de las proteínas es impedida una vez que las proteínas son fijos. Además, la solución STR-QD, que es elmás componente caro del experimento, se puede aplicar en una baja concentración optimizada, y esta segunda etapa de etiquetado no es momento crucial, es decir, el QD se puede acoplar en varios minutos.

Para estudiar la estequiometría de EGFR como distribuido en células enteras, las muestras celulares se prepararon en los microchips de silicio ^18. Después de aplicar el etiquetado QD de dos pasos, y la grabación de imágenes de microscopía de fluorescencia, las células se enjuagaron con agua pura, y la imagen en estado hidratado utilizando ESEM-STEM ^19. Las imágenes correlativos resultantes proporcionan información sobre la distribución EGFR celular, y la estequiometría en su contexto natural de las células hidratadas. Un método similar se utilizó para estudiar las proteínas HER2 en células de cáncer de mama en un estudio reciente ^7.

Protocol

1. Preparación de Etiquetado y Fijación Reactivos Preparar tampón de etiquetado (BSA-GEL-PBS) usando solución salina tamponada con fosfato en autoclave, pH 7,4 (PBS). Suplemento con 1% de BSA (albúmina bovina fracción V, biotina-libre) y el 0,2% de gelatina (GEL, con piel de pescado de agua fría) y agitar / agitar bien. Nota: se puede almacenar durante ~ 5 días a 4 ° C. Preparar tampón de lavado (PBS-BSA) a partir de tampón fosfato salino autoclave, pH 7,4. Suplemento con 1% de BSA y torbellino / agitar bien. Nota: se puede almacenar durante ~ 5 días a 4 ° C. Preparar 50 mM de tampón de borato (BB) de 200 mM de stock de solución de ácido bórico, pH ajustado a 8,3 con 200 mM tetraborato de sodio. Nota: se puede almacenar durante ~ 12 meses a 4 ° C. Prepare 0,1 M tampón cacodilato (CB) de la solución de cacodilato de sodio 0,2 M de stock, pH ajustado a 7,4, suplementado con 0,1 M de sacarosa. Nota: solución madre Inaugurado se puede almacenar durante ~ 5 días a 4 ° C. Preparar 0,1 M glicina en PBS (GLY-PBS). Nota: se puede almacenar durante ~ 2 meses a 4 ° C. Preparar 3% de paraformaldehído en CB (3% PFA) de recién hecho o abierto vial de 16% PFA, solución madre, EM grado. Nota: solución madre Inaugurado se puede almacenar durante ~ 5 días a 4 ° C. Prepare 2% de glutaraldehído en CB (2% GA) desde recién hecho (o se abre vial de) 25% GA solución madre, EM grado. Nota: solución madre Inaugurado se puede almacenar durante ~ 5 días a 4 ° C. Prepare la solución de etiquetado 300 nM EGF-biotina Diluir 6 mM solución madre-EGF biotina en BSA-GEL-PBS, utilice un volumen de 100 a 200 l por microchip. Utilizar dentro de unas pocas horas. Preparar 10 solución de etiquetado nM STR-QD Centrifugar la solución de estreptavidina-QD durante 4 minutos a 8.000 xg, tome sobrenadante y diluir 1:10 en BB. Los diferentes tipos de puntos cuánticos se pueden utilizar, por ejemplo, QD655, o QD800. Diluir a una concentración final en BSA-PBS-GEL, utilizar de 75-100 l por microchip. Utilizar dentrounas pocas horas. 2. Preparación de nitruro de silicio de membrana Microchips Limpiar un portaobjetos de microscopio, tal como se utiliza para la microscopía de luz, con un pañuelo habitación limpia y cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) etanol grado. En un banco de trabajo flujo de aire laminar con un bajo nivel de polvo, abra un diámetro placa de Petri de 100 mm, y sentar las vidrio microscopio limpiado en el plato; dejar el plato abierto. Con pinzas limpias, preferentemente recubiertas con fibra de carbono u otro revestimiento, tomar 4-10 microchips con (50 nm) membranas de nitruro de silicio delgadas, uno después del otro, fuera de su caja de almacenamiento y sobre el portaobjetos de vidrio. Coge los microchips suavemente a los lados y evite tocar la parte superior frágil, que consiste en la membrana de nitruro de silicio delgada. Tenga mucho cuidado de mantener siempre el lado de la membrana y no lo toque. Nota: Los microchips deben ser rectangulares y tienen bordes planos perpendiculares a su nitruro de silicio cubiertocara, de manera que se pueden agarrar fácilmente. Cierre la tapa de la caja de Petri y llevarlo a una campana de humos. Obtener un nuevo tejido habitación limpia y depositarlo junto a la placa de Petri. Preparar dos vasos de precipitados de 200 ml limpio de vidrio rellenando una con un 50-70 ml de acetona, y el otro con un volumen similar de etanol, tanto de grado HPLC. La transferencia de los microchips de la primera lámina de vidrio sobre el tejido de sala limpia. Desde el tejido, transferir microchips uno por uno en el primer vaso de precipitados con acetona para retirar la capa protectora resistir. Espere 2 min, mientras se mueve suavemente el vaso de precipitados de un par de veces para asegurar que los microchips son bien enjuagadas. La transferencia de los microchips directamente en el vaso de precipitado con etanol, sin dejar que se sequen. Espere 2 minutos. A continuación, traslado el vaso a la mesa de trabajo de flujo de aire laminar. Obtener un nuevo tejido de sala limpia. Transferir las fichas sobre el tejido y dejar secar durante unos minutos. La transferencia de los microchips en el portaobjetos de vidrio en la placa de Petri, cierre el plato,y llevarlo a la limpiadora de plasma. Depositar el portaobjetos de vidrio con los microchips en el limpiador de plasma. Ejecutar un programa de limpieza 5 min para hacer que la superficie de la membrana hidrófila nitruro de silicio. Nota: Los valores adecuados aplicados para nuestro limpiador de plasma son: 70 mTorr, el flujo de gas de 11,5 sccm de O 2 y 35,0 sccm de Ar, 50 W hacia adelante de radiofrecuencia (RF) de destino, rango de RF 5 W y max. reflejado RF. Coloque el portaobjetos de vidrio con el microchip de nuevo en la placa de Petri, y cerrar su tapa. Tenga cuidado de mantener los microchips estéril a partir de ahora. Examine las áreas de la ventana de los microchips bajo un microscopio de luz de posibles rupturas de membranas o partículas de suciedad restantes. Traiga la placa de Petri a la mesa de trabajo de flujo de aire laminar. Coloque los siguientes elementos en la mesa de trabajo de flujo de aire laminar: tubos / botellas que contienen esterilizados 0,01% de poli-L-lisina solución (. PLL, peso molecular 150.000-300.000, esterilizada por filtración, y el cultivo de células probado), HPLCagua de calidad, Medio Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado con 10% de suero bovino fetal, DMEM sin suero, un nuevo tejido de sala limpia, una placa de 24 pocillos estériles (una placa de 12 pocillos también se puede utilizar), un estéril 96- así plato, puntas de pipeta estériles, una pipeta, y plana, punta redondeada, pinzas. Tome la placa de 24 pocillos, y llenar un pozo con PLL, y dos pozos con agua grado HPLC, use un aprox. volumen de 1 ml por pocillo. Tome la placa de 96 pocillos y rellenar para cada microchip dos pozos con suero suplementado DMEM y un pocillo con DMEM sin suero, utilice un aprox. volumen de 200 l por pocillo. A partir de ahora use pinzas con puntas estériles para manejar los microchips. Lograr esto, por ejemplo, mediante flameado brevemente y posteriormente refrescarse las puntas de las pinzas. En primer lugar la transferencia de los microchips de la lámina de vidrio sobre el tejido de sala limpia. Desde el tejido, transferir hasta seis microchips en lleno-PLL pozo, incubar los microchips durante 5 min. Noe: Para un experimento con más microchips, llenar pozos adicionales en la placa de 24 pocillos. Posteriormente enjuagar los microchips mediante la colocación de ellos, uno por uno, en el primer pocillo lleno de agua, y desde allí en el segundo lleno de agua también. No deje los microchips en el agua más de un minuto para evitar la eliminación de PLL. Por último colocar individualmente en los pocillos llenos-DMEM de la placa de 96 pocillos. Almacenar la placa de 96 pocillos en la incubadora de CO 2 hasta que se prepara la suspensión de células. 3. Preparación de las células en Microchips Realizar un subcultivo de las células COS7 para preparar una suspensión de células con una concentración de aprox. 5 × 10 5 células / ml. Asegúrese de que las células son mono-dispersado. Tome la placa de 96 pocillos con los microchips y añadir una gota de suspensión celular a cada microchip. Espere 5 min. Empezar a examinar las áreas de la ventana de los microchips con un microscopio invertido de Choose el momento adecuado para la transferencia en un nuevo pozo con DMEM sin suero. Nota: Una buena densidad de células se consigue con aproximadamente una célula por 2,500 m 2 zona, correspondiente a 24 células COS7 en un tamaño de ventana de 150 x 400 m. Densidades celulares más altas tienen el riesgo de obstaculizar aplanamiento máxima de las células. Tenga en cuenta que después de una célula se ha establecido sobre la membrana SIN, necesita 3-5 minutos para desarrollar lo suficiente adherencia para resistir flotando durante la transferencia al nuevo pozo. Transferencia microchip a la siguiente bien cuando suficientes células se han adherido a la ventana. Mantenga los microchips siempre con las células hacia arriba y evitar cualquier contacto de este lado. Después de la transferencia, examine cada ventana microchip nuevo. Si demasiadas células se lavaron y el número de células que quedan son insuficientes, vuelva a triturar la suspensión celular (para romper grupos de células recién formadas) y repita los pasos 3.1 a 3.5. Cuando todos los microchips transferidos tienen suficienteadherirse las células en sus áreas de la ventana, la transferencia de las fichas en el último pocillo con DMEM sin ​​suero. Coloque la placa de 96 pocillos de nuevo en la incubadora de CO 2 y dejar que las células se recuperen y aplanar para varias horas, el mejor O / N. 4. EGFR Etiquetado, Fijación y microscopía de fluorescencia Para los siguientes pasos, utilice un 96 pocillos y una placa de 24 pocillos. Pre-llenar los pocillos con las soluciones respectivas, y utilizar una fila o columna por microchip. La placa 24 también se utiliza bajo la campana de humos para los pasos de fijación con CB, PFA y GA. Siempre transferir microchips con las células hacia arriba y evitar cualquier contacto de este lado. Enjuague microchips mediante la colocación de los microchips en un pozo con fresco BSA-GEL-PBS, a continuación, colocar placa de 96 pocillos en incubadora a 37 ° C durante 5 min. Incubar con 300 solución de EGF biotina nM durante 3 minutos a 37 ° C. Debido a que las células comenzarán endocitosis de EGFR EGF marcado, haga lo más rápido posible para step 4,4. Enjuagar 3 veces con PBS y 1 vez con CB (ahora la placa de 96 pocillos es de nuevo a temperatura ambiente). Incubar en 3% PFA durante 10 min. Enjuague chips de 1 hora con el CB, y 3 veces con PBS. Incubar en GLY-PBS durante 2 min, enjuague 2 veces con PBS 1 vez. Incubar en 10 nM STR-QD durante 10 min. Enjuague 4 veces con BSA-PBS. Sumerja un microchip en un 35 mm plato de fondo de vidrio precargada con BSA-PBS a RT. Adquirir imágenes de contraste de interferencia diferencial (DIC) y las imágenes de fluorescencia de las células marcadas con QD. Utilice un objetivo de aire 40X para imágenes descripción de células marcadas con QD655. Utilice un objetivo de inmersión en aceite (por ejemplo, 63X) para permitir la colección más eficiente de la luz fluorescencia emitida; esto es especialmente necesario cuando imágenes de células marcadas con QD800. Utilice un cubo de filtro que expone los puntos cuánticos a la luz de excitación de fluorescencia entre 340 y 380 nm, y permite la recogida de la luz emitida por encima de 420 nm suimesa para la mayoría de los puntos cuánticos (Filtro de cubo A, en este caso). Minimizar la intensidad de la luz para evitar la luz demasiado intensa que pudiera dañar la muestra. Ajuste el tiempo de exposición a al menos 300 ms, de modo que se capturan las señales de todos los puntos cuánticos, y señaló que la fluorescencia de puntos cuánticos tiene un comportamiento intermitente. Ajuste la intensidad de la luz, y la amplificación para proporcionar imágenes brillantes y sin ruido de la imagen visible, y reducir al mínimo la intensidad de la luz. Nota: Como alternativa, más corto el tiempo de exposición se puede utilizar si la serie de imágenes se toman de la misma región. Estas series se puede procesar para producir una imagen de proyección máxima, dando lugar a la reducción de ruido promedio y por lo tanto de la imagen resultante. Coloque el microchip fotografiado espalda (células hacia arriba) en un pocillo de una placa de 96 pocillos llena de BSA-PBS. Enjuague microchips 1 veces en CB. Incubar en 2% GA durante 10 min. Enjuague 1 vez en la CB, y 3 veces con BSA-PBS. Microchips tienda hasta ESEM imaging, en BSA-PBS pozos pre-llenado de una nueva placa de 96 pocillos. Para cada microchip llenar una fila de cuatro pozos con agua de grado HPLC. Nota: Las muestras pueden mantenerse a 4 ° C durante varias semanas, sin embargo, los mejores resultados se obtienen cuando se lleva a cabo la serie de imágenes completa dentro de dos días. Puntos cuánticos poco a poco comienzan a desprenderse de la muestra, por lo tanto, no se recomienda que esperar más de 10 días antes de realizar la imagen ESEM. Nota: Las imágenes de fluorescencia se almacenan para el análisis futuro. Las posiciones de las células en las imágenes pueden ser fácilmente correlacionados con imágenes de microscopía electrónica a través de la localización de las esquinas de la ventana de SiN y la medición de las posiciones relativas a las esquinas. Nota: Se recomienda para imprimir imágenes de fluorescencia de alta calidad y utilizarlos para fines de orientación al grabar las imágenes ESEM. 5. Wet ESEM-STEM de células enteras Prepare el ESEM de STEM húmeda Monte la gaseosa de electrones d secundariaetector (GSED), y la etapa Peltier, que contiene el detector STEM (ubicado debajo de la muestra). Inicie el flujo de agua de refrigeración a través de la etapa, y ajustar la temperatura de 3 ° C. Establezca la xy etapa coordina a cero, y ajustar la distancia de trabajo de aproximadamente 6 mm. Durante la proyección de imagen ESEM, mantenga la placa de 96 pocillos con los microchips se enfrían, por ejemplo en elementos de refrigeración congelados, en una caja de espuma de poliestireno. Para cargar una muestra en la etapa ESEM-STEM preenfriada, tomar la placa de 96 pocillos del recipiente de enfriamiento y colocarlo cerca del escenario ESEM abierto. Ponga un nuevo tejido sala blanca al lado de él. Enjuagar rápidamente un microchip (con las células hacia arriba) por inmersión cuatro veces, cada vez durante un segundo, en un pozo lleno de agua grado HPLC. Seque la parte trasera del microchip brevemente sobre el tejido habitación limpia y colocar el microchip en la etapa de pre-enfriada. Asegúrese de que las células permanecen húmedas, esto puede serreconocida por una superficie reflectante (secado da como resultado una superficie mate). Humedezca la superficie de la muestra con 3 l de agua enfriada de grado HPLC (asegúrese de no tocar la superficie con la punta de la pipeta), y fijar la muestra en el escenario. Coloque tres gotas de agua 3 mu l adicionales en el escenario cerca de la muestra. Cierre la cámara de muestras Purgar la cámara de la muestra en bicicleta la presión cinco veces entre 800 y 1.500 Pa. Poner fin a la bicicleta con 800 Pa. Cambiar el haz de electrones (30 kV) y examinar en la muestra bajo el aumento más bajo con ambos detectores, es decir, el GSED, y el detector de STEM para buscar la ubicación de la ventana microchip. Nota: Si la capa de agua es demasiado gruesa, la ventana no puede ser visible. En este caso, empezar a bajar la presión a 760 Pa y esperar unos minutos. La ventana se vuelve visible por primera vez con el GSED. Coloque la ventana de membrana de pecado en el centro de la imagen moviendo el uestraen el escenario y reducir la presión a 750 a 720 Pa. Nota: Cuando la capa de agua es lo suficientemente delgada, la ventana también se hace visible con el detector de STEM. A partir de ahora utilización en el segmento de campo oscuro del detector STEM para grabar imágenes. En primer lugar, adquirir una o dos imágenes que muestran todas las células en el área completa de la ventana. Comparar estas imágenes ESEM con las imágenes de microscopía de luz, localizar las esquinas de la ventana SiN. Correlacionar la coordenada marcos de ambas modalidades de microscopía mediante la comparación de la ampliación, la rotación y la posible creación de reflejo. Localice las mismas células en ambas imágenes. Seleccione muy pequeñas partículas de suciedad o una región de células con características pequeñas para ajustar la configuración de imagen, como la altura eucéntrica, la multa enfoque y la corrección del astigmatismo de la lente. Trabajo con un aumento de al menos 50.000X, utilice una corriente de sonda de electrones alrededor de 0.6 nA, un tiempo de píxeles de permanencia de 30 mu s, y un tamaño de imagen de 1024 x 884 píxeles. Nota: Otros ajustes también pueden abe utiliza mientras se evita un aumento de la dosis de electrones. Nota: Incluso cuando se trabaja muy limpio, las superficies de chips estarán en la práctica siempre contener algunas partículas de suciedad, ya que el protocolo no se ejecuta en un entorno de sala limpia. Para grabar imágenes provienen de las células QD-etiquetados, consulte las imágenes de fluorescencia y elegir una célula de interés. Nota: Es mejor comenzar con una célula que muestra señales QD fuertes. Grabar una imagen general STEM de esta célula. Ir a una región periférica donde el borde de la celda es visible y acercar la imagen para llegar a la ampliación 50.000X. Graba imágenes que muestran puntos cuánticos individuales, utilizan píxeles tiempos de permanencia de 20 a 30 microsegundos. A fin de evitar el daño por radiación, imagen cada región de una sola vez con una gran ampliación. Nota: Por lo general, en esta etapa tanto, el enfoque y la corrección del astigmatismo, necesita un poco de ajuste fino. Después de la grabación de un número suficiente de imágenes de alta magnificación, zoom-out rápido y aire acondicionadoquire otra imagen Descripción STEM, que representa a las regiones simplemente grabados con alta magnificación como rectángulos oscuros. Nota: Estas imágenes Ficha posteriormente servirá para correlacionar ESEM de fluorescencia y las imágenes y para determinar la ubicación precisa de las imágenes de gran aumento en el contexto celular. Proceder a la siguiente célula de interés, comenzar con una imagen resumen, grabar una serie de imágenes de gran aumento, y terminar con una imagen de vista general. Al final de una sesión de imágenes ESEM, aumentar la presión de 850-900 Pa a antes de comenzar a ventilar la cámara. Nota: Este incremento de la presión mejora la posibilidad de recuperar el microchip con una superficie todavía mojada; sin embargo, esto no siempre se puede lograr. Una muestra que nunca se ha secado se puede restaurar en BSA-PBS y, si se desea, reinvestigados en el ESEM en un momento posterior en el tiempo.

Representative Results

Figura 1 y 2 muestran imágenes representativas de QD655 marcado, EGFR unido a la membrana visualizados en células COS-7 intactas, totalmente hidratados. La imagen DIC en la Figura 1 una da una impresión de la topografía de la membrana de las células, y la imagen de fluorescencia correspondiente en la Figura 1b representa la distribución de EGFR después de 3 min de-EGF Biotina incubación. La Figura 1A y B son cada uno unirán de de dos las imágenes grabadas con un objetivo 40X aire. El EGFR activado EGF se distribuye sobre toda la superficie celular. En la mayoría de las células de un ligero aumento de la fluorescencia (Figura 1B) se puede ver en los bordes de células, lo que indica un aumento localmente ocurrencia de EGFR 20. Los experimentos de control realizados utilizando un protocolo similar verifican EGFR etiquetado específico (datos no presentados). Estos controles incluyen: 1) un etiquetado de control sin incubación previa de la ceLLS con EGF-biotina, es decir, solamente la incubación con STR-puntos cuánticos, y 2) una incubación con EGF no biotinilado y STR-puntos cuánticos. Las tres casillas marcadas con rectángulos se investigaron más con ESEM-STEM. Las imágenes ESEM-STEM representados en la Figura 1C – E muestran vistas generales bajos de ampliación de estas células. Estas imágenes de transmisión reflejan células enteras en estado hidratado con una fina capa de agua que residen sobre la celda se coloca en un microchip de silicio con nitruro de silicio (SiN) ventana de visualización. La cámara de vacío en el vapor de agua contenida microscopio, y el equilibrio entre temperatura de la muestra y la presión se ajustó para mantener una fina capa de líquido sobre las células. Las células individuales se pueden reconocer fácilmente por su forma y ubicación en la ventana de membrana SiN. Los de baja magnificación imágenes ESEM-STEM revelan estructuras finas, como filopodios, que se extiende desde el borde de la celda hacia las células vecinas, y algunas estructurasdentro de las regiones de células más delgadas. Regiones celulares central gruesa incluyendo el núcleo aparecen de color blanco ya que la transmisión a través de la muestra no es posible para los electrones de la energía utilizada (30 keV). Imágenes de alta resolución ESEM-STEM se registraron en las regiones periféricas más delgadas. La resolución espacial de ESEM-STEM de nanopartículas en las regiones delgadas de células en una capa líquida delgada se determinó en un estudio previo de 6 a ascender a 3 nm. Cuatro imágenes de alta resolución que se muestran en la Figura 2A – D se registraron a las ubicaciones de los pequeños rectángulos de la figura 1C – E. El usa magnificación fue suficiente para discernir los puntos cuánticos individuales, que aparecen como barras brillantes, con forma de bala, cada uno vinculado a un individuo EGFR. El QD655 tiene dimensiones típicas de 6 x 14 nm 2. Figura 2A (correspondiente al área rectangular indicada en la celda en la Figure 1C) muestra las etiquetas QD sobre una membrana se pliegan en diagonal que cruza la imagen. Esta estructura de la membrana tiene una densidad EGFR superior a las regiones de la membrana de los alrededores. En varios lugares, dos etiquetas se encontraban en las proximidades. Dos ejemplos con distancias de 20 y 24 nm se indican con flechas. Estos pares de etiquetas se interpretan como pertenecientes a dímeros EGFR. La Figura 2B muestra un ejemplo desde el borde de una célula (Figura 1D, rectángulo izquierda), monómeros de EGFR y dímeros pueden ser vistos también. Figura 2C (Figura 1C, rectángulo derecha) fue grabado de una región con una señal de fluorescencia inferior, es decir, menor densidad de EGFR. Sin embargo, EGFR también se encontró aquí en dímeros también. Además, dos grupos de 10 o 11 EGFRs estaban presentes (ver elipses). La figura 2D muestra otro ejemplo de un pliegue de la membrana (Figura 1E) con los racimos más pequeños, incluyendo 5-6 EGFR, además de varios monómerosy dímeros. Como un ejemplo de la clase de información que se puede obtener a partir de estos datos, el par de correlación de función 21 g (x) se determinó para todas las posiciones de la etiqueta en la figura 2. Tenga en cuenta que este análisis no es parte de este protocolo y el procedimiento fue descrito en otra parte 6,7. g (x) es una medida de la probabilidad de que una partícula que se encuentran dentro de una cierta distancia radial x de una partícula de referencia. g (x) = 1 representa una distribución aleatoria, y un valor más grande es la evidencia para el agrupamiento. Las posiciones de un total de 210 etiquetas se detectaron automáticamente en las cuatro imágenes de la Figura 2A-D, y g (x) se calculó utilizando un tamaño de bin de 5 nm y un filtro de suavizado con un ancho de banda de 10 nm. El g (x) curva (Figura 3) muestra una preferida QD distancia de centro a centro de 25 nm. EGFR por lo tanto no están orientadas al azar, pero una fracción significativa de ellas reside en esta distancia preferida. Desde un approximate modelo molecular 6 (Figura 3 recuadro) estimamos que la distancia de centro a centro entre el QD y el bolsillo de unión de EGF asciende a ~ distancia 14 nm, y de centro a centro entre los dos puntos cuánticos conectados a un dímero EGFR a ser ~ 27 nm (este valor puede variar por unos pocos nanómetros debido a la flexibilidad del enlazador). La distancia etiqueta preferida es así coherente con la distancia etiqueta esperado para el dímero EGFR dentro de la precisión del método. El g (x) curva es mayor que la unidad para la distancia de hasta 300 nm, lo que indica la presencia de grupos, consistente con los datos. Este análisis muestra que la estequiometría de la EGFR puede ser estudiado con nuestro método. Figura 4 muestra un resultado similar a la Figura 2, excepto que el etiquetado se realizó con EGF-QD800, y un objetivo de inmersión en aceite 63X se utilizó para la imagen de fluorescencia. Estos datos confirman que también se encuentran estos resultados típicos cuandoel etiquetado EGFR se realiza con puntos cuánticos, que emiten en el espectro rojo cerca. La Figura 4A es la imagen de fluorescencia de una célula representativa, la figura 4B muestra la misma célula en el modo de visión general ESEM-STEM y la Figura 4C es una imagen de magnificación 150.000 x, grabada en la frontera de la membrana superior de la célula (véase el rectángulo en la Figura 4B). Similar a la Figura 2A y D, las imágenes captan EGFR marcado con QD en un pliegue de la membrana y muestra receptores monómeros, dímeros, y agrupados. Tenga en cuenta que el electrón del núcleo QD densa aparece más redondo un poco más pequeño y que los núcleos de los puntos cuánticos que emite a 655 nm, en consonancia con su tamaño de núcleo más pequeño de 22 ~ 5 nm. Figura 1. correlativa DIC, fluorescencia y ESEM-STEM de EGF-QD655 etiquetado EGFR en COS-7 totalmente hidratados células </strong>. de imagen (A) DIC de las células cultivadas en el área de la ventana de membrana SiN, dando una impresión topográfico de la membrana plasmática. (B) Imagen de fluorescencia que muestra células en la ventana de membrana SiN céntrico (marcada por el rectángulo de trazos). (C – E) Tres ESEM-STEM imágenes de baja magnificación de las casillas marcadas con rectángulos en A y B. Estas imágenes Ficha célula sirven para determinar la ubicación precisa de imágenes de alta resolución posteriormente grabadas. La ubicación de cuatro imágenes de alta resolución (que se muestran en la Figura 2A-D) se marcan con rectángulos blancos. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. <strong> Figura 2. Imágenes de alta resolución ESEM-STEM representa unidas a la membrana EGFR. (A) Micrografía con una ampliación 75,000X del área marcada en la figura 1B. Muchos monómeros son visibles. Varios dímeros se indican con las puntas de flecha. Imágenes (C) adquiridas a un aumento de 50,000X de la izquierda (B) y, respectivamente, las zonas correctas, la membrana marcados en la Figura 1C. Los racimos de EGFR se describen. Imagen (D) grabado con magnificación 50,000X en el lugar marcado en la Figura 1D. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 3. Par función de correlación g (x) en función de la distancia radial x determina para la inter-parti distancias CLE de los 210 etiquetas detectadas en la Figura 2A-D. El pico a 25 nm indica que un QD distancia de centro-a-centro tiene una probabilidad mucho mayor de que ocurra que al azar, con lo cual ag (x) = 1 indica una posibilidad aleatoria. La línea discontinua es una guía para el ojo que representa g (x) de una distribución aleatoria. El recuadro muestra un modelo molecular aproximado del dímero EGFR con EGF atado y puntos cuánticos recubiertas con estreptavidina conectados a través de la biotina. Los modelos de estreptavidina, EGF y el EGFR se obtuvieron a partir de modelos de CPK del 1stp (estreptavidina), 1EGF (EGF), 1NQL, 2JWA, 1M17, las estructuras en la proteína RCSB Protein banco de datos, creado por Jmol Version 1IVO y 2GS6 (EGFR) 02/12/15. El modelo de biotina es como se dibuja en RCSB Ligando Explorer versión 1.0. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. /53186/53186fig4.jpg "/> Figura 4. Ejemplar COS-7 de células marcadas con EGF-QD800 y fotografiado con fluorescencia correlativa y ESEM-STEM. (A) Imagen de fluorescencia, (B) Descripción general del bajo porcentaje de la imagen ESEM-STEM. Imagen de alta resolución grabada en la ubicación del rectángulo en b en 150,000X aumento (C). EGFR monómeros, dímeros, y agrupados se detectan similar al etiquetado con EGF-QD655. 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Discussion

El estudio de la distribución espacial y la estequiometría de las proteínas de membrana, tales como el EGFR, en células enteras proporciona información de contexto importante acerca de su función y posibles cambios de los mismos ^11-14. Es un reto para estudiar la distribución de monómeros, dímeros, y clusters directamente en un nivel subcelular utilizando métodos bioquímicos usados ​​comúnmente, para lo cual se pierde la información sobre la localización de la proteína en la célula o diferencias entre las células ^15. Los métodos de etiquetado y microscopía descritos aquí permiten la visualización de los complejos de proteínas en una escala de longitud de unos pocos nanómetros de modo que su estequiometría puede ser estudiado en el contexto de las células individuales, intactos ^4-7. Esto no es posible con (súper resolución) microscopía de luz ^23, ya que su resolución no es suficiente para distinguir las moléculas que participan en un complejo de proteínas. Förster de transferencia de energía de resonancia (FRET) es una técnica de promediado de conjunto <sup> 24, y no detecta necesariamente los dímeros y clusters de orden superior, como consecuencia del corto alcance de la transferencia de energía ^25. Ensayos de ligadura de proximidad ²⁶ no miden realmente las distancias y por lo tanto no son capaces de distinguir entre una región celular con una alta densidad de proteínas, inevitablemente, conduce a una serie de cercanías detectados por casualidad, de una región celular con una densidad de proteínas similares, pero que contiene proteínas complejos que presentan distintas distancias entre las etiquetas. La alta resolución requerida para visualizar los componentes de complejos de proteínas se logra mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM). Sin embargo, TEM convencional de células enteras está limitado por el requisito de muestras delgadas / secciones cortando a través de la membrana plasmática ^27, o la membrana plasmática de rasgadura o que interrumpen ^28,29 resultando en formados al azar pequeños trozos de membrana. La membrana plasmática por lo tanto no se forma la imagen en su conjunto, lo que lleva a una faltainformación de contexto celular de posiblemente crucial.

Otros retos experimentales para el estudio de la estequiometría proteína en las células se derivan de la proteína de etiquetado aplicada. Comúnmente immunolabeling utilizado lleva la dificultad que uno-a-uno estequiometría entre el receptor y la etiqueta sólo se puede lograr con una sonda monovalente; este no es el caso cuando se requieren anticuerpos primarios y secundarios. Para obtener información acerca de la estequiometría de proteínas, se requiere que una sonda se une única para un epítopo en el receptor y tiene un sitio de unión para una sonda fluorescente o un alto número atómico de nanopartículas en el otro lado. En segundo lugar, la precisión alcanzable con el anticuerpo etiquetado se limita a causa de su gran tamaño ³⁰ a 30 nm, de modo que una discriminación entre proteínas vecinos individuales, homodímeros, o grupos más grandes no es factible, al menos no para receptores de la familia EGFR. Etiquetas específicas mucho más pequeñas son conocidos en la literatura y la can aplicarse incluso para el marcaje intracelular ³¹ pero los que no son de uso común. La longitud de toda la etiqueta (EGF-biotina-estreptavidina-QD) es de una dimensión similar a la del EGFR, y suficientemente pequeño para ser capaz de detectar el dímero. Por otra parte, el procedimiento de marcaje en dos etapas descrito evita etiquetado inducida por la agrupación de receptores.

Nuestro método no es muy difícil, no mucho más de microscopía de fluorescencia de proteínas marcadas. Sin embargo, un experimento necesita ser llevado a cabo con gran cuidado, ya que el número de pasos de suma y un error en uno de los pasos puede dar lugar a un fracaso total en el experimento. Manejo de los microchips no es más tedioso que el manejo de las rejillas TEM, pero algunos chips vacíos de formación se recomienda. ESEM-STEM de las células hidratadas enteros es probablemente el aspecto más difícil, y requiere al menos un operador experto y varios días de práctica con el fin de llegar a una solución en torno a 3 nm, según sea necesario para visualizar los puntos cuánticos. Presa de radiaciónla edad de la muestra bajo investigación presenta un riesgo. La presión y la temperatura deben ser vigilados cuidadosamente para mantener una capa de agua. Por otra parte, el espesor de la capa de agua puede variar entre las células. Es aconsejable para controlar la presencia de la capa de agua utilizando el detector de electrones gaseosa por encima de la muestra, tal como se describe en otro lugar ^6. Regiones celulares sólo deberían obtenerse imágenes de una o dos veces para evitar daños.

Una limitación clave del método es que la información de alta resolución sobre la ultraestructura está ausente. Otras técnicas, por ejemplo, TEM cryo, se necesitan para estudiar la estructura de la proteína, y la ultraestructura celular ^15. En segundo lugar, el estudio de la interacción dinámica de un múltiplo de proteínas en células vivas en el microscopio de lapso de tiempo no es factible debido a los daños por radiación, y requiere el estado de la técnica de microscopía de luz ^23. Actualmente, nuestro método no es capaz de determinar el nivel absoluto de dímeros ya que el leficiencia Abeling es desconocida, pero se espera añadir estos datos en el futuro. Sin embargo, es posible decir si los dímeros están presentes o no. Desde la literatura se sabe, que incluso un etiquetado de eficiencia en torno al 15% es suficiente para detectar dímeros con la suficiente significación estadística ^32.

Es fácilmente posible estudiar otros receptores unidos a la membrana a través de su ligando, a través de biotinilados fragmentos Fab de anticuerpos específicos, o mediante otros enlazadores pequeños ⁷ utilizando el protocolo de marcaje en dos etapas descrito. Como ya hemos demostrado que dos colores diferentes (tamaños) de los puntos cuánticos pueden ser usados, y el etiquetado nanopartícula de oro se utilizó en el trabajo previo ^6, parece factible para etiquetar múltiples especies de proteínas en el mismo experimento. El desafío clave para el estudio de la estequiometría de múltiples especies de proteínas es asegurar una eficiencia similar etiquetado para ambas especies o por lo menos una normalización de la estequiometría relativa obtenida en el respetoive eficiencia de etiquetado. Sin embargo, los dos puntos cuánticos diferentes utilizadas en este estudio no parecen diferir mucho en la eficiencia de etiquetado (véanse las Figuras 2 y 4). El método descrito implica el etiquetado de dos pasos con puntos cuánticos, y microscopía de fluorescencia correlativa y ESEM-STEM presenta un método viable para estudiar la compleja interacción de proteínas de membrana en las membranas plasmáticas de células enteras intactas.

Materials

Inverted fluorescence microscope	Leica	AF6000 + DMI6000B
ESEM	FEI Company	Quanta 400 FEG
Chemicals
DMEM (1x) + GlutaMax + glucose + pyruvate	Gibco	31966-021
DPBS (1x) – Calcium chloride – Magnesium chlorid	Gibco	14190-144
Fetal bovine serum, Performance Plus (FBS)	Gibco	16000-036
Cellstripper	Mediatech, Inc.	25-056 Cl
Water, chromasolv Plus for HPLC	Sigma-Aldrich	34877-2.5L
PBS Roti-Stock 10x PBS	Carl Roth	1058.1
Ethanol, Rotisolv HPLC grade	Carl Roth	P076.2
Albumin Fraction V, biotin-free (BSA)	Carl Roth	O163.2
Gelatin, from cold water fish skin	Sigma-Aldrich	G7041-500G
Glycine	Carl Roth	T873.1
shoul	Molecular Probes	E3477
Sodium teraborate decahydrate	Sigma-Aldrich	S9640-500G
Boric acid	Sigma-Aldrich	B6768-500G
Qdot 655 streptavidin conjugate	Molecular Probes	Q10121MP
Qdot 800 streptavidin conjugate	Molecular Probes	Q10173MP
Materials
Silicon microchips with silicon nitride membranes	DENS Solutions	Custom made
of 50 nm thickness and dimensions of 50 µm x 0.40 mm