Intracerebroventricular وداخل الأوعية الدموية حقن الفيروسية الجسيمات ونيون ميكروبيدات في الدماغ حديثي الولادة
Summary
Here, we describe a simple method of intracerebroventricular and intravascular injection of viral particles or fluorescent microbeads into the neonatal mouse brain. The localization pattern of the virus and nanoparticles could be detected by microscopic evaluation or by in situ hybridization.
Abstract
في دراسة عن التسبب في التهاب الدماغ الفيروسي، وطريقة العدوى أمر بالغ الأهمية. أول اثنين من الطرق الرئيسية المعدية إلى الدماغ هو الطريق الدموي، الذي ينطوي على إصابة الخلايا البطانية وpericytes من الدماغ. والثاني هو intracerebroventricular (ICV) الطريق. مرة واحدة في الجهاز العصبي المركزي (CNS)، وقد تنتشر الفيروسات إلى الفضاء تحت العنكبوتية، السحايا، والضفيرة المشيمية عبر السائل المخي الشوكي. في النماذج التجريبية، المراحل الأولى من توزيع الفيروسي الجهاز العصبي المركزي لا تتسم بشكل جيد، وأنه من غير الواضح ما إذا كانت مصابة فقط خلايا معينة في البداية. هنا، قمنا بتحليل توزيع جزيئات الفيروس المضخم للخلايا (CMV) أثناء المرحلة الحادة من الإصابة، ووصف فيروسية الدم الأساسي، بعد ICV أو داخل الأوعية (IV) الحقن في مخ الفأر حديثي الولادة. في نموذج حقن ICV، تم حقن 5 ميكرولتر من الفيروس المضخم للخلايا الفئران (MCMV) أو ميكروبيدات الفلورسنت إلى البطين الجانبي في midpoiالإقليم الشمالي بين الأذن والعين باستخدام حقنة 10 ميكرولتر مع إبرة 27 G. في نموذج حقن الرابع، وكان يستخدم حقنة 1-مل مع إبرة 35 G. تم استخدام نقل transilluminator لتصور الزمان (الوجه) الوريد السطحي للفأرة حديثي الولادة. نحن غرست 50 ميكرولتر من MCMV أو ميكروبيدات الفلورسنت في الوريد الصدغي السطحي. تم حصادها العقول في مختلف نقاط الوقت بعد الحقن. تم الكشف عن الجينوم MCMV استخدام في طريقة التهجين الموضعي. وقد لوحظت ميكروبيدات الفلورسنت أو البروتين الفلوري الأخضر معربا عن جزيئات MCMV المؤتلف بواسطة المجهر الفلورسنت. هذه التقنيات يمكن تطبيقها على العديد من مسببات الأمراض الأخرى للتحقيق في التسبب في التهاب الدماغ.
Introduction
عند دراسة التهاب الدماغ الفيروسي، والتوزيع الأولي من الجسيمات الفيروسية مهم جدا لفهم المرض والتسبب في ولتحديد أهداف الفيروسية في المخ. وتتراوح معظم الفيروسات في حجم 20-300 نانومتر، على الرغم من أن Pandoravirus أكثر من 700 نانومتر في حجم 1. توزيع الجسيمات الفيروسية في المرحلة الحادة من العدوى قد يعتمد على حجم الجسيمات، وتوزيع المستقبلات الخلوية، أو تقارب من المستقبلات الخلوية للبحث عن الفيروسات. في النماذج الحيوانية، intracerebroventricular (ICV)، داخل الصفاق، المشيمة مباشرة، وعن طريق الوريد (IV) وقد استخدمت العدوى لدراسة المرضية لالتهاب الدماغ الفيروسي. ICV التلقيح بفيروس كثيرا ما يستخدم لإقامة التهابات الجهاز العصبي المركزي (CNS) في الفئران. الدراسات التي تستخدم هذه التقنية تفيد العدوى على نطاق واسع، وخاصة من الخلايا في المناطق المحيطة بالبطين وفي مناطق من الدماغ في اتصال مباشر مع السائل النخاعي (CSF)، متشابهةr لآثار ventriculoencephalitis الفيروسية. صغر حجم فيروس الغدة المرتبطة (AAV) الجسيمات (20 – 25 نانومتر في القطر) يسهل نشرها في جميع أنحاء الدماغ في التهابات ICV 2-4. داخل الصفاق 5، المشيمة مباشرة 6، والرابع حقن 7 تمثل إدارة النظامية دموية المنشأ. تغلغل الجزيئات الفيروسية من خلال حاجز الدم في الدماغ (BBB) يسمح لهم للوصول لحمة من الدماغ حديثي الولادة، وهو ما يمثل العقيدات دبقية صغيرة منتشرة 8،9.
الفيروس المضخم للخلايا (CMV) هو فيروس شائع الذي ينتمي إلى عائلة فيروس الهربس. في الولايات المتحدة، و 50٪ – وكان 80٪ من الناس عدوى الفيروس المضخم للخلايا التي كتبها سن 40. العدوى CMV نادرا ما تكون ضارة ولكن يمكن أن تسبب الأمراض في المرضى الذين يعانون من نقص المناعة والأجنة. من جميع الولادات، 0.2٪ – 2٪ يولدون مع CMV 10، مما أدى إلى أعراض حادة مثل صغر الرأس، تكلس حول البطينات الدماغية، تنسج المخيخ، ميكرالرمد، وضمور العصب البصري 11،12. وعلاوة على ذلك، والتخلف العقلي، وفقدان السمع الحسي العصبي، وعيوب بصرية والحجز، والصرع تحدث في حوالي 10٪ من غير قاتلة طفلا مصابا CMV 13،14. الجهاز العصبي المركزي الخلل هو العرض المميز الأكثر شيوعا من CMV الشذوذ الخلقي. وتعطيل المزيد من الأطفال بشكل دائم كل عام CMV الخلقي من قبل متلازمة داون، متلازمة الكحول الجنينية، أو السنسنة المشقوقة (15). هل هناك أي تطعيمات ضد الفيروس المضخم للخلايا متوفر في الوقت الحاضر، داعيا إلى ضرورة وجود لقاح آمن وفعال. دراسة التفاعل بين الجسيمات CMV مع مستقبلاتها في المرحلة الأولى من الإصابة مهم لفهم تأثير التطعيم.
Ventriculoencephalitis والعقيدات دبقية صغيرة منتشرة هما الخصائص المرضية الرئيسية CMV التهاب الدماغ (16). فقد كان غير مؤكد كيف جزيئات الفيروس المضخم للخلايا (150-300 نانومتر) تنتشر عبر المخ في المرحلة الحادة من الإصابة لالثانية كيفية توزيع المستقبلات الخلوية وحبهم للفيروسات يسهم في انتشار الفيروس. كاواساكي وآخرون. قمنا بتقييم ICV والرابع العدوى من وجهة نظر توزيع الجسيمات ومستقبلاتها (β1 إنتغرين) في المرحلة الأولى من الإصابة. لقد وجدنا أن نشر جزيئات الفيروس المضخم للخلايا والتعبير عن إنتغرين β1 هي مرتبطة بشكل جيد في المرحلة الأولى من العدوى في كل ICV والتهابات الرابع 8. عدوى ICV هو نموذج للventriculoencephalitis وإصابة الرابع هو نموذج من العقيدات دبقية صغيرة منتشرة. ان دراسة ديناميكية الجزيئات الفيروسية أو الفلورسنت إعطاء معلومات مفيدة عن تأثير حجم الجسيمات، والتفاعلات الفيروسية مع المستقبلات الخلوية، وآلية الاختراق BBB في الدماغ. ويمكن استخدام بروتوكول التالية للتحقيق في أي عدوى فيروسية وناقلات فيروسية في الجهاز العصبي المركزي.
Protocol
Representative Results
Discussion
في النماذج الحيوانية، ICV، داخل الصفاق، المشيمة مباشرة، والتهابات الرابع تم استخدامها لدراسة التسبب في التهاب الدماغ الفيروسي. ركزنا على ICV وحقن الرابع نماذج من الفئران حديثي الولادة لبساطة الإجراءات والاستفادة من الحقن المباشر للجزيئات في المنطقة المستهدفة. على ال…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Mr. Masaaki Kaneta, Ms. Hiromi Suzuki, and Ms. Mitsue Kawashima (Department of Regenerative and Infectious Pathology, Hamamatsu University School of Medicine) for their excellent technical assistance. This work was supported by the Japan Society for the Promotion of Science, KAKENHI Grant Number 23590445.
Materials
| Tris; tris(hydroxymethyl)- aminomethane | Sigma-Aldrich | T-6791 | |
| HCl | Sigma-Aldrich | H-1758 | |
| pEGFP-N1 vector | Clontech | #6085-1 | |
| D-sorbitol | Sigma-Aldrich | S-1876 | |
| SPHERO TM Fluorescent Polystyrene Nile Red 0.04-0.06 | Spherotech, Inc. | FP-00556-2 | |
| SPHERO TM Fluorescent Polystyrene Nile Red 0.1-0.3 | Spherotech, Inc. | FP-0256-2 | |
| SPHERO TM Fluorescent Polystyrene Nile Red 1.7-2.2 | Spherotech, inc. | FP-2056-2 | |
| 10% mouse serum | DAKO | X0910 | |
| C57BL/6 mouse | SLC, Inc. | ||
| ICR mouse | SLC, Inc. | ||
| Modified Microliter Syringes (7000 Series) | Hamilton company | ||
| 35-gauge needle | Saito Medical | ||
| A Wee Sight Transilluminator | Phillips Healthcare | 1017920 | |
| O.C.T.Compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| RNase A | Sigma-Aldrich | R4642 | |
| Nonidet(R) P-40 | Nacalai | 25223-04 | |
| citrate buffer (pH6) x10 | Sigma-Aldrich | C9999-100ml | |
| pepsin | Sigma-Aldrich | P6887 | |
| EDTA | dojindo | N001 | |
| Formamide | TCI | F0045 | |
| Dextran sulfate sodium salt | Sigma-Aldrich | 42867-5G | |
| Denhardt's Solution (50X) | ThermoFishcer sceintific | 750018 | |
| Yeast tRNA (10 mg/mL) | ThermoFishcer sceintific | AM7119 | |
| SSC x20 | Sigma-Aldrich | S6639 | |
| DAPI | ThermoFishcer sceintific | D1306 | |
| n-Hexane | Sigma-Aldrich | 296090 | |
| superfrost plus glass | ThermoFishcer sceintific | 12-55-18 | |
| Cytokeep II | Nippon Shoji Co. | ||
| FITC-conjugated Griffonia simplicifolia isolectin B4 | Vector laboratories, Inc. | L1104 | |
| Anti-Mouse CD31 (PECAM-1) PE | ebioscience | 12-0311 | |
| ProLong Gold | ThermoFishcer sceintific | P36934 | |
| BIOREVO | KEYENCE | BZ-9000E | |
References
- Philippe, N., et al. Pandoraviruses: amoeba viruses with genomes up to 2.5 Mb reaching that of parasitic eukaryotes. Science. 341 (6143), 281-286 (2013).
- Passini, M. A., et al. Intraventricular brain injection of adeno-associated virus type 1 (AAV1) in neonatal mice results in complementary patterns of neuronal transduction to AAV2 and total long-term correction of storage lesions in the brains of beta-glucuronidase-deficient mice. J Virol. 77 (12), 7034-7040 (2003).
- Kim, J. Y., et al. Viral transduction of the neonatal brain delivers controllable genetic mosaicism for visualising and manipulating neuronal circuits in vivo. Eur J Neurosci. 37 (8), 1203-1220 (2013).
- McLean, J. R., et al. Widespread neuron-specific transgene expression in brain and spinal cord following synapsin promoter-driven AAV9 neonatal intracerebroventricular injection. Neurosci Lett. 576, 73-78 (2014).
- Hsu, K. M., Pratt, J. R., Akers, W. J., Achilefu, S. I., Yokoyama, W. M. Murine cytomegalovirus displays selective infection of cells within hours after systemic administration. J Gen Virol. 90. 90 (Pt 1), 33-43 (2009).
- Sakao-Suzuki, M., et al. Aberrant fetal macrophage/microglial reactions to cytomegalovirus infection. Annals of Clinical and Translational Neruology. 1 (8), 570-588 (2014).
- Gombash Lampe, S. E., Kaspar, B. K., Foust, K. D. Intravenous injections in neonatal mice. J Vis Exp. (93), e52037 (2014).
- Kawasaki, H., et al. Cytomegalovirus initiates infection selectively from high-level beta1 integrin-expressing cells in the brain. Am J Pathol. 185 (5), 1304-1323 (2015).
- Rahim, A. A., et al. Intravenous administration of AAV2/9 to the fetal and neonatal mouse leads to differential targeting of CNS cell types and extensive transduction of the nervous system. FASEB J. 25 (10), 3505-3518 (2011).
- Cannon, M. J., Davis, K. F. Washing our hands of the congenital cytomegalovirus disease epidemic. Bmc Public Health. 5, (2005).
- Frenkel, L. D., Keys, M. P., Hefferen, S. J., Rola-Pleszczynski, M., Bellanti, J. A. Unusual eye abnormalities associated with congenital cytomegalovirus infection. Pediatrics. 66 (5), 763-766 (1980).
- Becroft, D. M. Prenatal cytomegalovirus infection: epidemiology, pathology and pathogenesis. Perspect Pediatr Pathol. 6, 203-241 (1981).
- Conboy, T. J., et al. Intellectual development in school-aged children with asymptomatic congenital cytomegalovirus infection. Pediatrics. 77 (6), 801-806 (1986).
- Fowler, K. B., et al. The outcome of congenital cytomegalovirus infection in relation to maternal antibody status. N Engl J Med. 326 (10), 663-667 (1992).
- Cannon, M. J. Congenital cytomegalovirus (CMV) epidemiology and awareness. J Clin Virol. 46 Suppl 4, S6-S10 (2009).
- Grassi, M. P., et al. Microglial nodular encephalitis and ventriculoencephalitis due to cytomegalovirus infection in patients with AIDS: two distinct clinical patterns. Clin Infect Dis. 27 (3), 504-508 (1998).
- Kawasaki, H., Mocarski, E. S., Kosugi, I., Tsutsui, Y. Cyclosporine inhibits mouse cytomegalovirus infection via a cyclophilin-dependent pathway specifically in neural stem/progenitor cells. J Virol. 81 (17), 9013-9023 (2007).
- Britt, W. J. Human cytomegalovirus: propagation, quantification, and storage. Curr Protoc Microbiol. Chapter 14, Unit 14E 13 (2010).
- Kawasaki, H., Kosugi, I., Arai, Y., Iwashita, T., Tsutsui, Y. Mouse embryonic stem cells inhibit murine cytomegalovirus infection through a multi-step process. PLoS One. 6 (3), e17492 (2011).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. (65), (2012).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Cutting sections of paraffin-embedded tissues. CSH Protoc. , (2008).
- Chi, V., Chandy, K. G. Immunohistochemistry: paraffin sections using the Vectastain ABC kit from vector labs. J Vis Exp. (8), e308 (2007).
- Wilsbacher, L. D., Coughlin, S. R. Analysis of cardiomyocyte development using immunofluorescence in embryonic mouse heart. J Vis Exp. (97), (2015).
- Ohshima, M., et al. Intraperitoneal and intravenous deliveries are not comparable in terms of drug efficacy and cell distribution in neonatal mice with hypoxia-ischemia. Brain Dev. 37 (4), 376-386 (2015).
- Kim, J. Y., Grunke, S. D., Levites, Y., Golde, T. E., Jankowsky, J. L. Intracerebroventricular viral injection of the neonatal mouse brain for persistent and widespread neuronal transduction. J Vis Exp. (91), e51863 (2014).
- Glascock, J. J., et al. Delivery of therapeutic agents through intracerebroventricular (ICV) and intravenous (IV) injection in mice. J Vis Exp. (56), (2011).
