Intracérébroventriculaire et intravasculaire Injection de particules virales et fluorescentes microbilles dans le cerveau néonatal
Summary
Here, we describe a simple method of intracerebroventricular and intravascular injection of viral particles or fluorescent microbeads into the neonatal mouse brain. The localization pattern of the virus and nanoparticles could be detected by microscopic evaluation or by in situ hybridization.
Abstract
Dans l'étude sur la pathogenèse de l'encéphalite virale, la méthode d'infection est critique. La première des deux voies principales infectieuses vers le cerveau est la voie hématogène, ce qui implique l'infection des cellules et les pericytes du cerveau endothéliales. Le second est le intracérébroventriculaire (ICV) itinéraire. Une fois dans le système nerveux central (SNC), les virus peuvent se propager dans l'espace sous-arachnoïdien, des méninges et plexus choroïde par le liquide céphalorachidien. Dans des modèles expérimentaux, les premiers stades de la distribution virale CNS ne sont pas bien caractérisées, et il est difficile de savoir si seules certaines cellules sont initialement infectées. Ici, nous avons analysé la distribution du cytomégalovirus (CMV) particules pendant la phase aiguë de l'infection, appelée virémie primaire, suivant ICV ou intravasculaire (IV) l'injection dans le cerveau de souris néonatale. Dans le modèle d'injection ICV, 5 pi de CMV murin (MCMV), ou des microbilles fluorescentes ont été injectées dans le ventricule latéral du midpoint entre l'oreille et l'oeil en utilisant une seringue de 10 ul avec une aiguille 27G. Dans le modèle d'injection intraveineuse, une seringue de 1 ml avec une aiguille de 35 G a été utilisée. Un transilluminateur a été utilisé pour visualiser le temps (faciale) veine superficielle de la souris néonatale. Nous infusé 50 pi de MCMV ou microbilles fluorescentes dans la veine temporale superficielle. Les cerveaux ont été récoltés à différents moments après l'injection. Génomes Mcmv ont été détectés en utilisant la méthode dans d'hybridation in situ. microbilles fluorescentes ou protéine fluorescente verte exprimant des particules Mcmv recombinantes ont été observées par microscopie à fluorescence. Ces techniques peuvent être appliquées à de nombreux autres agents pathogènes pour étudier la pathogenèse de l'encéphalite.
Introduction
Lorsque l'on étudie l'encéphalite virale, la distribution initiale des particules virales est très important de comprendre la pathogenèse de la maladie et d'identifier des cibles virales dans le cerveau. La plupart des virus varient en taille de 20 à 300 nm, bien que la pandoravirus est supérieure à 700 nm de taille 1. La distribution des particules virales dans la phase aiguë de l'infection peut dépendre de la taille des particules, la distribution des récepteurs cellulaires, ou l'affinité des récepteurs cellulaires pour le virus. Dans les modèles animaux, intracérébroventriculaire (ICV), intrapéritonéale, placentaires directe, et par voie intraveineuse (IV) infections ont été utilisées pour étudier la pathogenèse de l'encéphalite virale. ICV inoculation du virus est souvent utilisé pour établir le système nerveux (SNC) chez les souris centrales. Les études utilisant cette technique signalent une infection généralisée, en particulier de cellules dans les zones périventriculaires et dans les régions du cerveau en contact direct avec le liquide céphalo-rachidien (LCR), similar aux effets de ventriculoencephalitis virale. La petite taille du virus adéno-associé (AAV) , des particules (20 à 25 nm de diamètre) facilite leur diffusion dans le cerveau , dans les infections ICV 2-4. Intrapéritonéal 5, placentaires directe 6, et IV injections 7 représentent l' administration systémique hématogène. La pénétration des particules virales à travers la barrière hémato-encéphalique (BHE) leur permet d'atteindre le parenchyme du cerveau du nouveau – né, ce qui représente des nodules microgliales diffuses 8,9.
Cytomégalovirus (CMV) est un virus commun qui appartient à la famille des virus de l'herpès. Aux États-Unis, 50% – 80% des gens ont eu une infection à CMV par âge 40. les infections à CMV sont rarement dangereux, mais peuvent causer des maladies chez les patients immunodéprimés et les fœtus. De toutes les livraisons, 0,2% – 2% sont nés avec CMV 10, entraînant des symptômes sévères tels que microcéphalie, calcifications périventriculaires, hypoplasie cérébelleuse, microphtalmie, et le nerf optique atrophie 11,12. En outre, le retard mental, la surdité de perception, les défauts visuels, la saisie et l' épilepsie surviennent chez environ 10% des nourrissons infectées par le CMV non mortellement 13,14. un dysfonctionnement du SNC est le symptôme caractéristique la plus commune de CMV anomalie congénitale. Plus d' enfants sont handicapés de façon permanente chaque année par CMV congénitale que par le syndrome de Down, le syndrome d'alcoolisme foetal, ou le spina – bifida 15. Il n'y a pas de vaccins contre le CMV disponible à l'heure actuelle, appelant à un besoin d'un vaccin sûr et efficace. L'étude de l'interaction des particules CMV avec leurs récepteurs dans la première phase de l'infection est important de comprendre l'effet de la vaccination.
Ventriculoencephalitis et nodules microgliales diffuses sont les deux principales caractéristiques pathologiques de CMV encéphalite 16. Il a été incertain comment les particules CMV (150-300 nm) répartis à travers le cerveau dans la phase aiguë de l'infection d'unnd comment la distribution des récepteurs cellulaires et leur affinité pour les virus contribuent à la propagation virale. Kawasaki et al. Ont évalué ICV et IV infections du point de vue de la distribution des particules et de leurs récepteurs (β1 intégrines) dans la première phase de l' infection. Nous avons constaté que la diffusion de particules CMV et l'expression de β1 intégrines sont bien corrélées à la première phase de l' infection dans les deux ICV et les infections IV 8. infection ICV est un modèle de ventriculoencephalitis et l'infection IV est un modèle de nodules microgliales diffuses. L'étude de la dynamique des particules virales ou fluorescentes donnerait des informations utiles sur l'effet de la taille des particules, les interactions virales avec des récepteurs cellulaires, et le mécanisme de pénétration BBB dans le cerveau. Le protocole suivant peut être utilisé pour enquêter sur toute infection virale et vecteur viral dans le SNC.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans les modèles animaux, ICV, intrapéritonéale, placentaire directe, et les infections IV ont été utilisées pour étudier la pathogenèse de l'encéphalite virale. Nous nous sommes concentrés sur les modèles de ICV et d'injection IV de souris néonatales pour la simplicité des procédures et l'avantage de l'injection directe de particules dans la région cible. Bien que l' infection intrapéritonéale est une méthode facile, les particules virales se propagent de manière systémique par l…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Mr. Masaaki Kaneta, Ms. Hiromi Suzuki, and Ms. Mitsue Kawashima (Department of Regenerative and Infectious Pathology, Hamamatsu University School of Medicine) for their excellent technical assistance. This work was supported by the Japan Society for the Promotion of Science, KAKENHI Grant Number 23590445.
Materials
| Tris; tris(hydroxymethyl)- aminomethane | Sigma-Aldrich | T-6791 | |
| HCl | Sigma-Aldrich | H-1758 | |
| pEGFP-N1 vector | Clontech | #6085-1 | |
| D-sorbitol | Sigma-Aldrich | S-1876 | |
| SPHERO TM Fluorescent Polystyrene Nile Red 0.04-0.06 | Spherotech, Inc. | FP-00556-2 | |
| SPHERO TM Fluorescent Polystyrene Nile Red 0.1-0.3 | Spherotech, Inc. | FP-0256-2 | |
| SPHERO TM Fluorescent Polystyrene Nile Red 1.7-2.2 | Spherotech, inc. | FP-2056-2 | |
| 10% mouse serum | DAKO | X0910 | |
| C57BL/6 mouse | SLC, Inc. | ||
| ICR mouse | SLC, Inc. | ||
| Modified Microliter Syringes (7000 Series) | Hamilton company | ||
| 35-gauge needle | Saito Medical | ||
| A Wee Sight Transilluminator | Phillips Healthcare | 1017920 | |
| O.C.T.Compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| RNase A | Sigma-Aldrich | R4642 | |
| Nonidet(R) P-40 | Nacalai | 25223-04 | |
| citrate buffer (pH6) x10 | Sigma-Aldrich | C9999-100ml | |
| pepsin | Sigma-Aldrich | P6887 | |
| EDTA | dojindo | N001 | |
| Formamide | TCI | F0045 | |
| Dextran sulfate sodium salt | Sigma-Aldrich | 42867-5G | |
| Denhardt's Solution (50X) | ThermoFishcer sceintific | 750018 | |
| Yeast tRNA (10 mg/mL) | ThermoFishcer sceintific | AM7119 | |
| SSC x20 | Sigma-Aldrich | S6639 | |
| DAPI | ThermoFishcer sceintific | D1306 | |
| n-Hexane | Sigma-Aldrich | 296090 | |
| superfrost plus glass | ThermoFishcer sceintific | 12-55-18 | |
| Cytokeep II | Nippon Shoji Co. | ||
| FITC-conjugated Griffonia simplicifolia isolectin B4 | Vector laboratories, Inc. | L1104 | |
| Anti-Mouse CD31 (PECAM-1) PE | ebioscience | 12-0311 | |
| ProLong Gold | ThermoFishcer sceintific | P36934 | |
| BIOREVO | KEYENCE | BZ-9000E | |
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