신생아 뇌에 바이러스 성 입자와 형광 마이크로 비즈의 뇌실과 혈관 내 주입
Summary
Here, we describe a simple method of intracerebroventricular and intravascular injection of viral particles or fluorescent microbeads into the neonatal mouse brain. The localization pattern of the virus and nanoparticles could be detected by microscopic evaluation or by in situ hybridization.
Abstract
바이러스 성 뇌염의 발병 기전에 대한 연구에서, 감염 방법이 중요하다. 뇌의 두 가지 경로 감염성의 첫 번째는 내피 세포 및 뇌 혈관 주위 세포의 감염을 포함 혈행 경로이다. 두 번째는 뇌 실내 (ICV) 경로이다. 일단 중추 신경계 (CNS) 내의 바이러스는 뇌척수액을 통해 거미 막밑 공간 수막 및 맥락총에 퍼져있다. 실험 모델에서, CNS 바이러스 분포의 초기 단계에있어서 잘되지 않으며, 이는 특정 셀은 초기 감염 불분명하다. 여기서, 우리는 감염의 급성 단계에서 사이토 메갈로 바이러스 (CMV) 입자의 분포를 분석 한 신생아 마우스의 뇌에 ICV 또는 혈관 내 (IV) 주입에 이어 바이러스 혈증 차 불린다. ICV 주사 모델에서, 쥐 CMV (MCMV) 또는 형광 마이크로 비드 5 μL은 midpoi의 뇌실 주입했다NT를 27 G 바늘 10 μL 주사기를 사용하여 귀와 눈 사이. IV를 주입 모델에서 35 G 바늘을 1 mL를 주사기를 사용 하였다. transilluminator가이 신생 마우스의 표면 시간적 (얼굴) 혈관을 시각화 하였다. 우리는 표면 시간적 정맥에 MCMV 또는 형광 마이크로 비즈의 50 μl를 주입. 뇌는 서로 다른 시간 지점 포스트 분사에 수확 하였다. MCMV 게놈은 현장 하이브리드 방식의를 사용하여 검출되었다. 재조합 MCMV 입자를 발현하는 형광 마이크로 비드 또는 녹색 형광 단백질의 형광 현미경으로 관찰 하였다. 이러한 기술 뇌염의 발병 기전을 조사하기 위해 많은 다른 병원균에 적용될 수있다.
Introduction
바이러스 성 뇌염을 연구 할 때, 바이러스 입자의 초기 분포 질환 발병 기전을 이해하고 뇌에서 바이러스 타겟을 식별하는 것이 매우 중요하다. Pandoravirus 크기가 1에서 700 개 이상의 나노가 있지만 대부분의 바이러스는 20 ~ 300 nm의에서 크기가 다양합니다. 감염의 급성 단계에서 바이러스 입자의 분포는 입자의 크기, 세포 수용체의 분포, 또는 바이러스에 대한 세포 수용체의 친화력에 의존 할 수있다. 동물 모델, 뇌실 (ICV), 복강 내, 직접 태반, 정맥은 (IV) 감염은 바이러스 성 뇌염의 발병 기전을 연구하는 데 사용되었다합니다. ICV 바이러스 접종은 종종 마우스에서 중추 신경계 (CNS) 감염을 확립하기 위해 사용된다. 이 기술을 사용하여 연구는 특히 뇌실 주위 영역의 셀 및 뇌척수액 (CSF), simila 직접 접촉 뇌의 영역에서 광범위하게 감염 신고바이러스 ventriculoencephalitis의 효과에 대한 연구. 아데노 – 관련 바이러스 (AAV) 입자의 작은 크기 (20 – 25 nm의 직경)을 ICV 감염 2-4 뇌 전반에 걸쳐 그 보급을 용이하게한다. 복강 5, 직접 태반 6, IV 주사 7 hematogenic 전신 투여를 나타냅니다. 혈액 – 뇌 장벽 (BBB)을 통해 바이러스 입자의 침투들이 확산 소교 노쥴 8,9 나타내는 신생아의 뇌 실질에 도달 할 수있다.
거대 세포 바이러스 (CMV)는 헤르페스 바이러스 제품군에 속하는 흔한 바이러스입니다. 미국에서는 50 % – 국민의 80 %가 40 CMV 감염이 거의 유해하지만 면역 환자와 태아의 질병을 일으킬 수 있습니다 나이 CMV 감염이 있었다. 모든 배달 중 0.2 % – 2 %는 같은 소두증, 뇌실 주위 석회화, 소뇌 형성 부전, MICR 등의 심각한 증상을 초래, CMV (10)에 태어난안염, 및 시신경 위축 (11, 12). 또한, 정신 지체, 감각 신경성 난청, 시각 결함, 발작, 간질 비 치명적 CMV에 감염된 유아 13, 14의 약 10 %에서 발생한다. CNS 장애는 CMV 선천성 기형의 가장 흔한 특징적인 증상입니다. 더 많은 아이들이 영구적으로 다운 증후군, 태아 알코올 증후군, 또는 척추 피열 (15)보다는 선천성 CMV 매년 비활성화됩니다. 안전하고 효과적인 백신의 필요성을 요구, 본에서 CMV에 대한 어떤 예방 접종을 사용할 수 있습니다. 감염의 초기 단계에서 그 수용체와 CMV 입자의 상호 작용을 공부 백신의 효과를 이해하는 것이 중요하다.
Ventriculoencephalitis 및 확산 소교 결절은 CMV의 두 가지 주요 병리학 적 특성이 16 뇌염 있습니다. (- 300 내지 150 nm) 감염 (a)의 급성기에 뇌를 통해 확산 CMV 입자가 어떻게 불확실하고있다차 방법 세포 수용체의 분포 및 바이러스에 대한 자신의 친 화성이 바이러스 확산에 기여한다. 가와사키 외. ICV는 입자 및 감염의 초기 단계에서의 수용체 (β1 인테그린)의 분포의 관점에서 IV 감염을 평가했다. 우리는 CMV 입자와 β1의 인테그린의 발현의 보급이 잘 ICV 및 IV 감염 (8) 모두에서 감염의 초기 단계에 상관 관계가 있음을 발견했다. ICV 감염 ventriculoencephalitis의 모델 및 IV 감염 확산 소교 노쥴의 모델이다. 바이러스 또는 형광 입자의 역학을 공부하는 것은 입자 크기, 세포 수용체와 바이러스의 상호 작용, 뇌에 BBB 침투의 메커니즘의 효과에 대한 유용한 정보를 제공 할 것입니다. 다음 프로토콜은 CNS 어떤 바이러스 감염 및 바이러스 벡터를 조사하는데 사용될 수있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
동물 모델, ICV, 복강 내, 직접 태반 및 IV 감염에 바이러스 성 뇌염의 발병 기전을 연구하는 데 사용되었다. 우리는 절차의 간략화와 목표 영역에 입자를 직접 주입의 이익을 위해 신생 마우스의 ICV 및 IV 주입 모델에 초점을 맞추었다. 복강 내 감염 쉬운 방법이지만, 바이러스 입자는 간접 공정 5, 24을 통해 체계적으로 확산. 직접 태반 감염은 배아 전신 감염을 연구 할 수있는 좋은 방법입니…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Mr. Masaaki Kaneta, Ms. Hiromi Suzuki, and Ms. Mitsue Kawashima (Department of Regenerative and Infectious Pathology, Hamamatsu University School of Medicine) for their excellent technical assistance. This work was supported by the Japan Society for the Promotion of Science, KAKENHI Grant Number 23590445.
Materials
| Tris; tris(hydroxymethyl)- aminomethane | Sigma-Aldrich | T-6791 | |
| HCl | Sigma-Aldrich | H-1758 | |
| pEGFP-N1 vector | Clontech | #6085-1 | |
| D-sorbitol | Sigma-Aldrich | S-1876 | |
| SPHERO TM Fluorescent Polystyrene Nile Red 0.04-0.06 | Spherotech, Inc. | FP-00556-2 | |
| SPHERO TM Fluorescent Polystyrene Nile Red 0.1-0.3 | Spherotech, Inc. | FP-0256-2 | |
| SPHERO TM Fluorescent Polystyrene Nile Red 1.7-2.2 | Spherotech, inc. | FP-2056-2 | |
| 10% mouse serum | DAKO | X0910 | |
| C57BL/6 mouse | SLC, Inc. | ||
| ICR mouse | SLC, Inc. | ||
| Modified Microliter Syringes (7000 Series) | Hamilton company | ||
| 35-gauge needle | Saito Medical | ||
| A Wee Sight Transilluminator | Phillips Healthcare | 1017920 | |
| O.C.T.Compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| RNase A | Sigma-Aldrich | R4642 | |
| Nonidet(R) P-40 | Nacalai | 25223-04 | |
| citrate buffer (pH6) x10 | Sigma-Aldrich | C9999-100ml | |
| pepsin | Sigma-Aldrich | P6887 | |
| EDTA | dojindo | N001 | |
| Formamide | TCI | F0045 | |
| Dextran sulfate sodium salt | Sigma-Aldrich | 42867-5G | |
| Denhardt's Solution (50X) | ThermoFishcer sceintific | 750018 | |
| Yeast tRNA (10 mg/mL) | ThermoFishcer sceintific | AM7119 | |
| SSC x20 | Sigma-Aldrich | S6639 | |
| DAPI | ThermoFishcer sceintific | D1306 | |
| n-Hexane | Sigma-Aldrich | 296090 | |
| superfrost plus glass | ThermoFishcer sceintific | 12-55-18 | |
| Cytokeep II | Nippon Shoji Co. | ||
| FITC-conjugated Griffonia simplicifolia isolectin B4 | Vector laboratories, Inc. | L1104 | |
| Anti-Mouse CD31 (PECAM-1) PE | ebioscience | 12-0311 | |
| ProLong Gold | ThermoFishcer sceintific | P36934 | |
| BIOREVO | KEYENCE | BZ-9000E | |
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