Intracerebroventricular und intravaskuläre Injektion von Viruspartikeln und Fluorescent Microbeads in die neonatale Gehirn

Summary

Here, we describe a simple method of intracerebroventricular and intravascular injection of viral particles or fluorescent microbeads into the neonatal mouse brain. The localization pattern of the virus and nanoparticles could be detected by microscopic evaluation or by in situ hybridization.

Abstract

In der Studie über die Pathogenese von Virusenzephalitis, ist die Infektion Methode kritisch. Die erste der beiden Hauptinfektionswege zum Gehirn ist die hämatogene Route, die Infektion der Endothelzellen und Perizyten des Gehirns beinhaltet. Die zweite ist die intracerebroventricular (ICV) Route. Einmal innerhalb des zentralen Nervensystems (ZNS), ausbreiten können Viren auf den Subarachnoidalraum, Meningen und Plexus über den Liquor. In experimentellen Modellen werden die frühesten Stadien der ZNS-viralen Verbreitung nicht gut charakterisiert, und es ist unklar, ob nur bestimmte Zellen zunächst infiziert sind. Hier haben wir die Verteilung von Cytomegalovirus (CMV) Teilchen während der akuten Phase der Infektion untersucht, bezeichnet als primäre Virämie nach ICV oder intravaskulären (IV) Injektion in den neonatalen Mäusegehirn. Im ICV-Injektion-Modell, 5 ul murinen CMV (MCMV) oder fluoreszierenden Mikrokugeln wurden in den lateralen Ventrikel injiziert am midpoint zwischen dem Ohr und Auge, die eine 10-ul-Spritze mit einer Nadel 27 G verwendet wird. In der IV-Injektion-Modell, eine 1-ml-Spritze mit einer 35 G-Nadel verwendet wurde. Ein Durchleuchtungs wurde verwendet, um die oberflächliche zeitliche (facial) Vene des Neugeborenen Maus sichtbar zu machen. Wir infundiert 50 ul MCMV oder fluoreszierende Mikrokügelchen in die oberflächliche zeitliche Vene. Gehirne wurden zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Injektion geerntet. MCMV – Genome wurden unter Verwendung der in situ – Hybridisierungsverfahren nachgewiesen. Fluoreszierende Mikrokügelchen oder grün fluoreszierendes Protein exprimierenden rekombinanten MCMV Partikel wurden durch Fluoreszenzmikroskopie beobachtet. Diese Techniken können auf viele andere Pathogene angewendet werden, um die Pathogenese von Encephalitis zu untersuchen.

Introduction

Wenn virale Enzephalitis zu studieren, ist die initiale Verteilung viraler Partikel sehr wichtig Krankheitsentstehung zu verstehen und virale Targets im Gehirn zu identifizieren. Die meisten Viren im Bereich von 20 bis 300 nm in der Größe, obwohl die Pandoraviren mehr als 700 nm ¹ groß ist. Die Verteilung der viralen Partikel in der akuten Phase der Infektion kann auf die Größe der Partikel abhängen, die Verteilung von zellulären Rezeptoren oder die Affinität der zellulären Rezeptoren für Viren. In Tiermodellen intracerebroventricular (ICV), intraperitoneale, direkte Plazenta und intravenöse (IV) Infektionen verwendet wurden, um die Pathogenese von Virusenzephalitis zu studieren. ICV Inokulation mit dem Virus wird häufig verwendet, Zentralnervensystem (ZNS) Infektionen in Mäusen herzustellen. Studien dieser Technik berichten weit verbreitete Infektion verwendet, insbesondere von Zellen in der periventrikulären Zonen und in Regionen des Gehirns, in direktem Kontakt mit der Zerebrospinalflüssigkeit (CSF), similar zu den Wirkungen der viralen ventriculoencephalitis. Die geringe Größe des adeno-assoziierten Virus (AAV) Teilchen (20 bis 25 nm im Durchmesser) erleichtert ihre Verbreitung im Gehirn in ICV Infektionen ^2-4. Die intraperitoneale ^5, direkte Plazenta ⁶ und IV – Injektionen ⁷ repräsentieren hematogenic systemische Verabreichung. Das Eindringen von Viruspartikeln durch die Blut-Hirn – Schranke (BBB) ​​ermöglicht ihnen das Parenchym der neonatalen Gehirn zu erreichen, was diffuse microglial Knötchen ^8,9.

Cytomegalovirus (CMV) ist ein verbreitetes Virus, das das Herpes-Virus-Familie gehört. In den Vereinigten Staaten, 50% – 80% der Menschen haben CMV-Infektion durch das Alter hatte 40. CMV-Infektionen selten schädlich sind, aber Krankheiten bei Patienten mit geschwächtem Immunsystem und Föten führen. Von allen Lieferungen, 0,2% – 2% sind mit CMV ¹⁰ geboren, was zu schweren Symptomen wie Mikrozephalie, periventrikuläre Verkalkung, Kleinhirnhypoplasie, microphthalmia und Sehnervenatrophie ^11,12. Des Weiteren, geistige Retardierung, Innenohrschwerhörigkeit, Sehstörungen, Krampfanfällen und Epilepsie treten bei etwa 10% der nicht-tödlich CMV-infizierten Säuglingen ^13,14. ZNS-Dysfunktion ist die häufigste charakteristisches Symptom von CMV angeborene Anomalie. Mehr Kinder werden dauerhaft jedes Jahr durch kongenitale CMV als durch das Down – Syndrom, das fetale Alkoholsyndrom oder Spina bifida ¹⁵ deaktiviert. Es gibt keine Impfung gegen CMV in der Gegenwart, für ein Bedürfnis nach einem sicheren und wirksamen Impfstoff ruft. Untersuchung der Wechselwirkung von CMV-Teilchen mit ihren Rezeptoren in der frühesten Phase der Infektion ist wichtig, die Wirkung der Impfung zu verstehen.

Ventriculoencephalitis und diffuse Mikroglia Knötchen sind die beiden wichtigsten pathologischen Merkmale von CMV – ¹⁶ – Enzephalitis. Es ist ungewiss, wie die CMV-Partikel (150-300 nm) in der akuten Phase der Infektion eine durch das Gehirn ausgebreitetnd, wie die Verteilung von zellulären Rezeptoren und ihre Affinität für Viren tragen zur Ausbreitung des Virus. Kawasaki et al. Haben ICV und IV Infektionen aus der Perspektive der Verteilung der Teilchen und ihre Rezeptoren (β1 Integrin) in der frühesten Phase der Infektion beurteilt. Wir haben gefunden, dass die Verbreitung von CMV – Teilchen und der Expression von β1 – Integrin gut in der frühesten Phase der Infektion sowohl ICV und IV Infektionen ⁸ korreliert sind. ICV-Infektion ist ein Modell der ventriculoencephalitis und IV-Infektion ist ein Modell der diffusen Mikroglia Knötchen. auf die Wirkung der Teilchengröße, viral Wechselwirkungen mit Zellrezeptoren und den Mechanismus der BBB Eindringen in das Gehirn würde nützliche Information, die die Dynamik von viralen oder fluoreszierenden Teilchen zu studieren. Das folgende Protokoll kann jede viralen Infektionen und viralen Vektor in das ZNS zu untersuchen, verwendet werden.

Protocol

Alle experimentellen Protokolle wurden von der Animal Care Committee von Hamamatsu Universität School of Medicine zugelassen. 1. Herstellung von MCMV (Smith-Stamm) und rekombinante M32-enhanced Green Fluorescent Protein (EGFP) -MCMV Erzeugen rekombinante M32-EGFP-MCMV gemäß dem Verfahren wie folgt (1,2-1,9) und wie zuvor 8 beschrieben. Verwenden Sie abgeleitete rekombinante Viren aus dem Smith-Stamm von Wildtyp MCMV (Zugangsnummer: U68299). Insert EGFP (436…

Representative Results

In Untersuchungen zur Pathogenese von viralen Enzephalitis, ist die Infektion Verfahren wichtig. Die hämatogenen Weg stellt eine akute Infektion der Endothelzellen und Perizyten des Gehirns, während der ICV Route eine akute Infektion stellt über das CSF durch den Subarachnoidalraum ausbreitet, bis zu den Meningen und Plexus choroideus. Um die erste Verteilung der Partikel in akuten Enzephalitis analysieren, in – situ – Hybridisierung der MCMV Genome und die direkte B…

Discussion

In Tiermodellen, ICV, intraperitoneale, direkte Plazenta und IV-Infektionen verwendet wurden, die Pathogenese von Virusenzephalitis zu studieren. Wir konzentrierten uns auf die ICV und IV-Injektion Modelle von neugeborenen Mäusen für die Einfachheit der Verfahren und der Nutzen der direkten Injektion von Partikeln in den Zielbereich. Obwohl intraperitoneale Infektion ist eine einfache Methode, verteilt Viruspartikel systemisch über einen indirekten Prozess ^5,24. Direkte plazentaren Infektion ist eine gute …

Materials

Tris; tris(hydroxymethyl)- aminomethane	Sigma-Aldrich	T-6791
HCl	Sigma-Aldrich	H-1758
pEGFP-N1 vector	Clontech	#6085-1
D-sorbitol	Sigma-Aldrich	S-1876
SPHERO TM Fluorescent Polystyrene Nile Red 0.04-0.06	Spherotech, Inc.	FP-00556-2
SPHERO TM Fluorescent Polystyrene Nile Red 0.1-0.3	Spherotech, Inc.	FP-0256-2
SPHERO TM Fluorescent Polystyrene Nile Red 1.7-2.2	Spherotech, inc.	FP-2056-2
10% mouse serum	DAKO	X0910
C57BL/6 mouse	SLC, Inc.
ICR mouse	SLC, Inc.
Modified Microliter Syringes (7000 Series)	Hamilton company
35-gauge needle	Saito Medical
A Wee Sight Transilluminator	Phillips Healthcare	1017920
O.C.T.Compound	Sakura Finetek	4583
RNase A	Sigma-Aldrich	R4642
Nonidet(R) P-40	Nacalai	25223-04
citrate buffer (pH6) x10	Sigma-Aldrich	C9999-100ml
pepsin	Sigma-Aldrich	P6887
EDTA	dojindo	N001
Formamide	TCI	F0045
Dextran sulfate sodium salt	Sigma-Aldrich	42867-5G
Denhardt's Solution (50X)	ThermoFishcer sceintific	750018
Yeast tRNA (10 mg/mL)	ThermoFishcer sceintific	AM7119
SSC x20	Sigma-Aldrich	S6639
DAPI	ThermoFishcer sceintific	D1306
n-Hexane	Sigma-Aldrich	296090
superfrost plus glass	ThermoFishcer sceintific	12-55-18
Cytokeep II	Nippon Shoji Co.
FITC-conjugated Griffonia simplicifolia isolectin B4	Vector laboratories, Inc.	L1104
Anti-Mouse CD31 (PECAM-1) PE	ebioscience	12-0311
ProLong  Gold	ThermoFishcer sceintific	P36934
BIOREVO	KEYENCE	BZ-9000E