Intracerebroventricular y por inyección intravascular de partículas víricas y fluorescentes microperlas en el cerebro neonatal
Summary
Here, we describe a simple method of intracerebroventricular and intravascular injection of viral particles or fluorescent microbeads into the neonatal mouse brain. The localization pattern of the virus and nanoparticles could be detected by microscopic evaluation or by in situ hybridization.
Abstract
En el estudio de la patogénesis de la encefalitis viral, el método de infección es crítica. La primera de las dos principales vías de infección en el cerebro es la vía hematógena, que implica la infección de las células endoteliales y pericitos del cerebro. La segunda es la vía intracerebroventricular (ICV). Una vez dentro del sistema nervioso central (CNS), los virus pueden propagarse al espacio subaracnoideo, meninges, y el plexo coroideo a través del líquido cefalorraquídeo. En modelos experimentales, las etapas más tempranas de la distribución viral SNC no están bien caracterizadas, y no está claro si están infectadas inicialmente sólo ciertas células. Aquí, hemos analizado la distribución de partículas de citomegalovirus (CMV) durante la fase aguda de la infección, llamada viremia primaria, después de la inyección ICV o intravascular (IV) en el cerebro del ratón neonatal. En el modelo de inyección ICV, se inyectaron 5 l de CMV murino (MCMV) o microperlas fluorescentes en el ventrículo lateral en el midpoint entre el oído y el ojo usando una jeringa de 10 l con una aguja de 27 G. En el modelo de la inyección IV, se usó una jeringa de 1 ml con una aguja de 35 G. Un transiluminador se utiliza para visualizar la vena superficial temporal (facial) del ratón neonatal. Infundido 50 l de MCMV o microperlas fluorescentes en la vena temporal superficial. Los cerebros se recogieron a diferentes puntos de tiempo después de la inyección. Genomas MCMV se detectaron utilizando el método de hibridación in situ. microperlas fluorescentes o proteína fluorescente verde que expresan partículas MCMV recombinantes se observaron por microscopía fluorescente. Estas técnicas se pueden aplicar a muchos otros patógenos para investigar la patogénesis de la encefalitis.
Introduction
Cuando se estudia la encefalitis viral, la distribución inicial de las partículas virales es muy importante para comprender la patogénesis de la enfermedad y para identificar dianas virales en el cerebro. La mayoría de los virus varían en tamaño de 20 a 300 nm, aunque la pandoravirus es de más de 700 nm de tamaño 1. La distribución de las partículas virales en la fase aguda de la infección puede depender del tamaño de las partículas, la distribución de los receptores celulares, o la afinidad de los receptores celulares en busca de virus. En modelos animales, intracerebroventricular (ICV), intraperitoneal, placentarios directa, y por vía intravenosa (IV) infecciones se han utilizado para estudiar la patogénesis de la encefalitis viral. ICV inoculación con virus se utiliza a menudo para establecer infecciones del sistema nervioso central (SNC) en ratones. Los estudios que utilizan esta técnica informan infección generalizada, particularmente de las células en las zonas periventriculares y en las regiones del cerebro en contacto directo con el líquido cefalorraquídeo (CSF), similar a los efectos de ventriculoencefalitis viral. El pequeño tamaño de virus adeno-asociado (AAV) partículas (20 – 25 nm de diámetro) facilita su difusión por todo el cerebro en las infecciones ICV 2-4. Intraperitoneales 5, 6 placentarios directa, y las inyecciones IV 7 representan administración sistémica hematógena. La penetración de partículas virales a través de la barrera hematoencefálica (BBB) permite a llegar a la parénquima del cerebro neonatal, que representa nódulos microgliales difusas 8,9.
El citomegalovirus (CMV) es un virus común que pertenece a la familia de los virus herpes. En los Estados Unidos, el 50% – 80% de las personas han tenido la infección por CMV por los 40 años las infecciones por CMV rara vez son perjudiciales, pero pueden causar enfermedades en pacientes inmunocomprometidos y los fetos. De todos los partos, 0,2% – 2% nacen con CMV 10, dando lugar a síntomas graves, como microcefalia, calcificación periventricular, hipoplasia cerebelosa, microftalmía, y la atrofia del nervio óptico 11,12. Por otra parte, el retraso mental, pérdida de la audición neurosensorial, defectos visuales, convulsiones y la epilepsia se presentan en aproximadamente el 10% de los lactantes infectadas por CMV no fatalmente 13,14. disfunción del SNC es el síntoma característico más común del CMV anomalía congénita. Más niños están desactivadas de forma permanente cada año por CMV congénito que por el síndrome de Down, síndrome de alcoholismo fetal, o espina bífida 15. No hay vacunas contra el CMV disponibles en la actualidad, pidiendo una necesidad de una vacuna segura y eficaz. El estudio de la interacción de las partículas de CMV con sus receptores en la fase más temprana de la infección es importante para entender el efecto de la vacunación.
Ventriculoencefalitis y nódulos microgliales difusas son las dos principales características patológicas de la encefalitis por CMV 16. Ha sido incierto cómo las partículas de CMV (150 – 300 nm) se extienden a través del cerebro en la fase aguda de la infección de unand cómo la distribución de los receptores celulares y su afinidad por los virus contribuyen a la propagación viral. Kawasaki et al. Han evaluado ICV y IV infecciones desde la perspectiva de la distribución de partículas y sus receptores (β1 integrina) en la fase más temprana de la infección. Hemos encontrado que la difusión de partículas de CMV y la expresión de la integrina β1 se correlaciona bien en la fase más temprana de la infección en tanto ICV e infecciones IV 8. infección ICV es un modelo de ventriculoencefalitis e infección IV es un modelo de nódulos microgliales difusas. El estudio de la dinámica de las partículas virales o fluorescentes daría información útil sobre el efecto del tamaño de partícula, las interacciones virales con receptores celulares, y el mecanismo de penetración de la BHE en el cerebro. El siguiente protocolo se podría utilizar para investigar cualquier infección viral y el vector viral en el SNC.
Protocol
Representative Results
Discussion
En modelos animales, ICV, intraperitoneal, placenta directa, e infecciones IV se han utilizado para estudiar la patogénesis de la encefalitis viral. Nos centramos en los modelos de ICV e inyección IV de ratones recién nacidos por la simplicidad de los procedimientos y el beneficio de la inyección directa de partículas en la región de destino. Aunque la infección intraperitoneal es un método fácil, partículas virales propagan por vía sistémica a través de un proceso indirecto 5,24. infección plac…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Mr. Masaaki Kaneta, Ms. Hiromi Suzuki, and Ms. Mitsue Kawashima (Department of Regenerative and Infectious Pathology, Hamamatsu University School of Medicine) for their excellent technical assistance. This work was supported by the Japan Society for the Promotion of Science, KAKENHI Grant Number 23590445.
Materials
| Tris; tris(hydroxymethyl)- aminomethane | Sigma-Aldrich | T-6791 | |
| HCl | Sigma-Aldrich | H-1758 | |
| pEGFP-N1 vector | Clontech | #6085-1 | |
| D-sorbitol | Sigma-Aldrich | S-1876 | |
| SPHERO TM Fluorescent Polystyrene Nile Red 0.04-0.06 | Spherotech, Inc. | FP-00556-2 | |
| SPHERO TM Fluorescent Polystyrene Nile Red 0.1-0.3 | Spherotech, Inc. | FP-0256-2 | |
| SPHERO TM Fluorescent Polystyrene Nile Red 1.7-2.2 | Spherotech, inc. | FP-2056-2 | |
| 10% mouse serum | DAKO | X0910 | |
| C57BL/6 mouse | SLC, Inc. | ||
| ICR mouse | SLC, Inc. | ||
| Modified Microliter Syringes (7000 Series) | Hamilton company | ||
| 35-gauge needle | Saito Medical | ||
| A Wee Sight Transilluminator | Phillips Healthcare | 1017920 | |
| O.C.T.Compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| RNase A | Sigma-Aldrich | R4642 | |
| Nonidet(R) P-40 | Nacalai | 25223-04 | |
| citrate buffer (pH6) x10 | Sigma-Aldrich | C9999-100ml | |
| pepsin | Sigma-Aldrich | P6887 | |
| EDTA | dojindo | N001 | |
| Formamide | TCI | F0045 | |
| Dextran sulfate sodium salt | Sigma-Aldrich | 42867-5G | |
| Denhardt's Solution (50X) | ThermoFishcer sceintific | 750018 | |
| Yeast tRNA (10 mg/mL) | ThermoFishcer sceintific | AM7119 | |
| SSC x20 | Sigma-Aldrich | S6639 | |
| DAPI | ThermoFishcer sceintific | D1306 | |
| n-Hexane | Sigma-Aldrich | 296090 | |
| superfrost plus glass | ThermoFishcer sceintific | 12-55-18 | |
| Cytokeep II | Nippon Shoji Co. | ||
| FITC-conjugated Griffonia simplicifolia isolectin B4 | Vector laboratories, Inc. | L1104 | |
| Anti-Mouse CD31 (PECAM-1) PE | ebioscience | 12-0311 | |
| ProLong Gold | ThermoFishcer sceintific | P36934 | |
| BIOREVO | KEYENCE | BZ-9000E | |
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