הזרקת intracerebroventricular ו intravascular של חלקיקים נגיפיים ו פלורסנט microbeads לתוך המוח בילוד
Summary
Here, we describe a simple method of intracerebroventricular and intravascular injection of viral particles or fluorescent microbeads into the neonatal mouse brain. The localization pattern of the virus and nanoparticles could be detected by microscopic evaluation or by in situ hybridization.
Abstract
במחקר על בפתוגנזה של דלקת מוח ויראלית, שיטת ההדבקה היא קריטית. הראשון מבין שני מסלולי זיהומיות העיקריים למוח הוא הדרך hematogenous, הכוללת זיהום של תאי האנדותל pericytes של המוח. השני הוא intracerebroventricular המסלול (ICV). לאחר מכן, בתוך מערכת העצבים המרכזית (CNS), וירוסים עלולים להתפשט בחלל תת-העכבישים, קרומי המוח, ואת המקלעת דמתה עין באמצעות נוזל השדרה. במודלים ניסיוניים, בשלבים המוקדמים של ההפצה ויראלית CNS אינם מתאפיינים גם, ולא ברור אם תאים מסוימים רק בתחילה נגועים. הנה, יש לנו ניתחו את חלוקת ציטומגלווירוס (CMV) חלקיקים בשלב החריף של זיהום, כינה viremia העיקרי, בעקבות ICV או intravascular (IV) הזרקה לתוך המוח עכבר בילוד. במודל הזרקת ICV, 5 μl של murine CMV (MCMV) או microbeads פלורסנט הוזרקו החדר לרוחב בבית midpoiNT בין העין לאוזן באמצעות מזרק 10 μl עם מחט 27 G. במודל הזרקה IV, מזרק 1 מ"ל עם מחט 35 G היה בשימוש. Transilluminator שמש כדי להמחיש את הווריד (פנים) הזמני השטחי של העכבר בילוד. אנו חדורים 50 μl של MCMV או microbeads פלורסנט לווריד הזמני השטחי. המוח נקצרו בנקודות זמן שונות לאחר ההזרקה. הגנום MCMV התגלו באמצעות שיטת הכלאה באתרו. microbeads פלורסנט או חלבון פלואורסצנטי ירוק להביע חלקיקי MCMV רקומביננטי נצפה על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי. טכניקות אלה ניתן ליישם פתוגנים רבים אחרים לחקור בפתוגנזה של דלקת קרום המוח.
Introduction
כאשר לומדים אנצפליטיס ויראלי, חלוקת הראשונית של חלקיקים נגיפיים מאוד חשוב להבין בהיווצרות המחלה ולזהות מטרות ויראלי במוח. רוב הווירוסים טווח בגודל מ 20 כדי 300 ננומטר, למרות Pandoravirus הוא יותר מ -700 ננומטר בגודל 1. התפלגות החלקיקים הנגיפיים בשלב החריף של זיהום עלולה תלוי בגודל של החלקיקים, החלוקה קולטנית תאים, או הזיקה של קולטני התאים לאיתור וירוסים. במודלים של בעלי חיים, intracerebroventricular (ICV), intraperitoneal, שליה ישיר, ו תוך ורידי (IV) זיהומים שימשו ללמוד בפתוגנזה של דלקת המוח ויראלית. חיסון עם וירוס ICV משמש לעתים קרובות כדי להקים מערכת העצבים המרכזית (CNS) זיהומים בעכברים. מחקרים שעשה שימוש בטכניקה זו לדווח זיהום נפוץ, במיוחד של תאי אזורי periventricular וב האזורים במוח בקשר ישיר עם הנוזל השדרתי (CSF), similar להשפעות של ventriculoencephalitis ויראלי. גודלו הקטן של וירוס adeno הקשורים (AAV) חלקיקים (20 – 25 ננומטר בקוטר) הופך לפשוט תפוצתם בכל חלקי המוח זיהומים ICV 2-4. Intraperitoneal 5, שלית 6 ישירה, וזריקות IV 7 לייצג ממשל מערכתי hematogenic. חדירת חלקיקים נגיפיים דרך מחסום הדם-מוח (BBB) מאפשר להם להגיע parenchyma של המוח בילוד, המייצג גושים microglial מפוזר 8,9.
ציטומגלווירוס (CMV) הוא וירוס נפוץ שייך למשפחת וירוס ההרפס. בארצות הברית, 50% – 80% מהאנשים היו זיהום CMV לפי גיל 40. זיהומי CMV הם לעתים רחוקות מזיקים אבל יכולים לגרום למחלות בחולים ועוברים מדוכאי חיסון. מכלל הלידות, 0.2% – 2% נולדים עם CMV 10, וכתוצאה מכך תופעות חמורות כגון מיקרוצפליה, הסתיידות periventricular, hypoplasia המוח הקטן, micrדלקת העין, ואת עצב הראייה ניוון 11,12. יתר על כן, פיגור שכלי, איבוד שמיעה עצבי, פגמים חזותיים, התקף, אפילפסיה להתרחש כ -10% של אי-אנושות תינוקות CMV נגוע 13,14. תפקוד לקוי של מערכת העצבים המרכזית היא סימפטום אופייני הנפוצים ביותר של האנומליה המולדת CMV. עוד ילדים הם נכים לכל החיים בכל שנה על ידי CMV מולד מאשר תסמונת דאון, תסמונת אלכוהול עוברית, או ספינה ביפידה 15. אין חיסון נגד CMV זמין על ההווה, קוראת צורך של חיסון בטוח ויעיל. לימוד האינטראקציה של חלקיקי CMV עם קולטנים שלהם בשלב המוקדם של זיהום חשוב להבין את ההשפעה של החיסון.
Ventriculoencephalitis גושים microglial מפוזר הם שני מאפיינים פתולוגיים הראשי של CMV דלקת המוח 16. זה כבר לא ברור כיצד חלקיקי CMV (150 – 300 ננומטר) להפיץ דרך המוח בשלב החריף של זיהוםnd איך חלוקת קולטנים הסלולר זיקתם וירוסים תורמים להתפשטות ויראלית. קוואסאקי et al. הערך ICV ו- IV זיהומים מנקודת המבט של ההפצה של חלקיקים הקולטנים שלהם (integrin β1) בשלב המוקדם של זיהום. מצאנו כי הפצת חלקיקי CMV ואת הביטוי של integrin β1 מתואמת היטב בשלב המוקדם של זיהום בשני ICV ו- IV זיהומי 8. זיהום ICV הוא מודל של ventriculoencephalitis וזיהום IV הוא מודל של גושי microglial מפוזרים. לימוד הדינמיקה של חלקיקים נגיפיים או פלורסנט ייתן מידע שימושי על השפעת גודל החלקיקים, אינטראקציות ויראלי עם קולטני התאים, ואת מנגנון החדירה BBB במוח. הפרוטוקול הבא יכול לשמש כדי לחקור כל זיהום ויראלי וקטור ויראלי של מערכת העצבים המרכזי.
Protocol
Representative Results
Discussion
במודלים של בעלי חיים, ICV, intraperitoneal, שליה ישירה, וזיהומי IV שמש ללמוד בפתוגנזה של דלקת מוח ויראלית. התמקדנו דגמי ICV ו- IV הזרקה של עכברים בילוד עבור הפשטות של הנהלים לטובת הזרקה ישירה של חלקיקים לתוך אזור היעד. למרות זיהום intraperitoneal הוא שיטה קלה, חלקיקים נגיפיים להפיץ מערכתי ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Mr. Masaaki Kaneta, Ms. Hiromi Suzuki, and Ms. Mitsue Kawashima (Department of Regenerative and Infectious Pathology, Hamamatsu University School of Medicine) for their excellent technical assistance. This work was supported by the Japan Society for the Promotion of Science, KAKENHI Grant Number 23590445.
Materials
| Tris; tris(hydroxymethyl)- aminomethane | Sigma-Aldrich | T-6791 | |
| HCl | Sigma-Aldrich | H-1758 | |
| pEGFP-N1 vector | Clontech | #6085-1 | |
| D-sorbitol | Sigma-Aldrich | S-1876 | |
| SPHERO TM Fluorescent Polystyrene Nile Red 0.04-0.06 | Spherotech, Inc. | FP-00556-2 | |
| SPHERO TM Fluorescent Polystyrene Nile Red 0.1-0.3 | Spherotech, Inc. | FP-0256-2 | |
| SPHERO TM Fluorescent Polystyrene Nile Red 1.7-2.2 | Spherotech, inc. | FP-2056-2 | |
| 10% mouse serum | DAKO | X0910 | |
| C57BL/6 mouse | SLC, Inc. | ||
| ICR mouse | SLC, Inc. | ||
| Modified Microliter Syringes (7000 Series) | Hamilton company | ||
| 35-gauge needle | Saito Medical | ||
| A Wee Sight Transilluminator | Phillips Healthcare | 1017920 | |
| O.C.T.Compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| RNase A | Sigma-Aldrich | R4642 | |
| Nonidet(R) P-40 | Nacalai | 25223-04 | |
| citrate buffer (pH6) x10 | Sigma-Aldrich | C9999-100ml | |
| pepsin | Sigma-Aldrich | P6887 | |
| EDTA | dojindo | N001 | |
| Formamide | TCI | F0045 | |
| Dextran sulfate sodium salt | Sigma-Aldrich | 42867-5G | |
| Denhardt's Solution (50X) | ThermoFishcer sceintific | 750018 | |
| Yeast tRNA (10 mg/mL) | ThermoFishcer sceintific | AM7119 | |
| SSC x20 | Sigma-Aldrich | S6639 | |
| DAPI | ThermoFishcer sceintific | D1306 | |
| n-Hexane | Sigma-Aldrich | 296090 | |
| superfrost plus glass | ThermoFishcer sceintific | 12-55-18 | |
| Cytokeep II | Nippon Shoji Co. | ||
| FITC-conjugated Griffonia simplicifolia isolectin B4 | Vector laboratories, Inc. | L1104 | |
| Anti-Mouse CD31 (PECAM-1) PE | ebioscience | 12-0311 | |
| ProLong Gold | ThermoFishcer sceintific | P36934 | |
| BIOREVO | KEYENCE | BZ-9000E | |
References
- Philippe, N., et al. Pandoraviruses: amoeba viruses with genomes up to 2.5 Mb reaching that of parasitic eukaryotes. Science. 341 (6143), 281-286 (2013).
- Passini, M. A., et al. Intraventricular brain injection of adeno-associated virus type 1 (AAV1) in neonatal mice results in complementary patterns of neuronal transduction to AAV2 and total long-term correction of storage lesions in the brains of beta-glucuronidase-deficient mice. J Virol. 77 (12), 7034-7040 (2003).
- Kim, J. Y., et al. Viral transduction of the neonatal brain delivers controllable genetic mosaicism for visualising and manipulating neuronal circuits in vivo. Eur J Neurosci. 37 (8), 1203-1220 (2013).
- McLean, J. R., et al. Widespread neuron-specific transgene expression in brain and spinal cord following synapsin promoter-driven AAV9 neonatal intracerebroventricular injection. Neurosci Lett. 576, 73-78 (2014).
- Hsu, K. M., Pratt, J. R., Akers, W. J., Achilefu, S. I., Yokoyama, W. M. Murine cytomegalovirus displays selective infection of cells within hours after systemic administration. J Gen Virol. 90. 90 (Pt 1), 33-43 (2009).
- Sakao-Suzuki, M., et al. Aberrant fetal macrophage/microglial reactions to cytomegalovirus infection. Annals of Clinical and Translational Neruology. 1 (8), 570-588 (2014).
- Gombash Lampe, S. E., Kaspar, B. K., Foust, K. D. Intravenous injections in neonatal mice. J Vis Exp. (93), e52037 (2014).
- Kawasaki, H., et al. Cytomegalovirus initiates infection selectively from high-level beta1 integrin-expressing cells in the brain. Am J Pathol. 185 (5), 1304-1323 (2015).
- Rahim, A. A., et al. Intravenous administration of AAV2/9 to the fetal and neonatal mouse leads to differential targeting of CNS cell types and extensive transduction of the nervous system. FASEB J. 25 (10), 3505-3518 (2011).
- Cannon, M. J., Davis, K. F. Washing our hands of the congenital cytomegalovirus disease epidemic. Bmc Public Health. 5, (2005).
- Frenkel, L. D., Keys, M. P., Hefferen, S. J., Rola-Pleszczynski, M., Bellanti, J. A. Unusual eye abnormalities associated with congenital cytomegalovirus infection. Pediatrics. 66 (5), 763-766 (1980).
- Becroft, D. M. Prenatal cytomegalovirus infection: epidemiology, pathology and pathogenesis. Perspect Pediatr Pathol. 6, 203-241 (1981).
- Conboy, T. J., et al. Intellectual development in school-aged children with asymptomatic congenital cytomegalovirus infection. Pediatrics. 77 (6), 801-806 (1986).
- Fowler, K. B., et al. The outcome of congenital cytomegalovirus infection in relation to maternal antibody status. N Engl J Med. 326 (10), 663-667 (1992).
- Cannon, M. J. Congenital cytomegalovirus (CMV) epidemiology and awareness. J Clin Virol. 46 Suppl 4, S6-S10 (2009).
- Grassi, M. P., et al. Microglial nodular encephalitis and ventriculoencephalitis due to cytomegalovirus infection in patients with AIDS: two distinct clinical patterns. Clin Infect Dis. 27 (3), 504-508 (1998).
- Kawasaki, H., Mocarski, E. S., Kosugi, I., Tsutsui, Y. Cyclosporine inhibits mouse cytomegalovirus infection via a cyclophilin-dependent pathway specifically in neural stem/progenitor cells. J Virol. 81 (17), 9013-9023 (2007).
- Britt, W. J. Human cytomegalovirus: propagation, quantification, and storage. Curr Protoc Microbiol. Chapter 14, Unit 14E 13 (2010).
- Kawasaki, H., Kosugi, I., Arai, Y., Iwashita, T., Tsutsui, Y. Mouse embryonic stem cells inhibit murine cytomegalovirus infection through a multi-step process. PLoS One. 6 (3), e17492 (2011).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. (65), (2012).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Cutting sections of paraffin-embedded tissues. CSH Protoc. , (2008).
- Chi, V., Chandy, K. G. Immunohistochemistry: paraffin sections using the Vectastain ABC kit from vector labs. J Vis Exp. (8), e308 (2007).
- Wilsbacher, L. D., Coughlin, S. R. Analysis of cardiomyocyte development using immunofluorescence in embryonic mouse heart. J Vis Exp. (97), (2015).
- Ohshima, M., et al. Intraperitoneal and intravenous deliveries are not comparable in terms of drug efficacy and cell distribution in neonatal mice with hypoxia-ischemia. Brain Dev. 37 (4), 376-386 (2015).
- Kim, J. Y., Grunke, S. D., Levites, Y., Golde, T. E., Jankowsky, J. L. Intracerebroventricular viral injection of the neonatal mouse brain for persistent and widespread neuronal transduction. J Vis Exp. (91), e51863 (2014).
- Glascock, J. J., et al. Delivery of therapeutic agents through intracerebroventricular (ICV) and intravenous (IV) injection in mice. J Vis Exp. (56), (2011).
