Intracerebroventriculaire en Intravasculaire Injectie van virusdeeltjes en TL Microkralen in de Neonatale Brain
Summary
Here, we describe a simple method of intracerebroventricular and intravascular injection of viral particles or fluorescent microbeads into the neonatal mouse brain. The localization pattern of the virus and nanoparticles could be detected by microscopic evaluation or by in situ hybridization.
Abstract
In het onderzoek naar de pathogenese van virale encefalitis, de infectie werkwijze kritisch. De eerste van de twee besmettelijke routes naar de hersenen de hematogene route, die infectie van de endotheelcellen en pericyten van de hersenen betreft. De tweede is de intracerebroventriculaire (ICV) route. Eenmaal binnen het centrale zenuwstelsel (CNS), kunnen virussen verspreiden naar de subarachnoïdale ruimte, meninges, choroidea plexus en via de cerebrospinale vloeistof. In experimentele modellen, zijn de vroegste stadia van CNS virale verspreiding niet goed gekarakteriseerd, en het is onduidelijk of alleen bepaalde cellen eerst geïnfecteerd. Hier hebben we de verdeling van cytomegalovirus (CMV) deeltjes geanalyseerd tijdens de acute fase van de infectie, genaamd primaire viremie na ICV of een intraveneuze (IV) injectie in de neonatale muizenhersenen. In de ICV injectie model, 5 pl van muizen CMV (MCMV) of fluorescente microbolletjes werden geïnjecteerd in het laterale ventrikel op de midpoint tussen het oor en oog met behulp van een 10-ul spuit met een 27 G naald. In de IV injectie model, een 1-ml spuit met een 35 G naald werd gebruikt. Een transilluminator werd gebruikt om de oppervlakkige temporale (gezichts) ader van de neonatale muis visualiseren. We toegediend 50 pl MCMV of fluorescerende microbolletjes in de oppervlakkige temporale ader. De hersenen werden geoogst op verschillende tijdstippen na de injectie. MCMV genomen werden gedetecteerd met de in situ hybridisatie methode. Fluorescente microbolletjes of groen fluorescent eiwit recombinant MCMV deeltjes werden waargenomen met fluorescentiemicroscopie. Deze technieken kunnen worden toegepast op vele andere pathogenen aan de pathogenese van encefalitis onderzoeken.
Introduction
Bij het bestuderen virale encefalitis, de initiële verdeling van virale deeltjes is zeer belangrijk om ziekte pathogenese begrijpen en virale targets te identificeren in de hersenen. De meeste virussen variëren in grootte van 20 tot 300 nm, hoewel de Pandoravirus meer dan 700 nm in grootte 1. De verdeling van de virale deeltjes in de acute fase van de infectie kan afhangen van de grootte van de deeltjes, de verdeling van cellulaire receptoren, of de affiniteit van de cellulaire receptoren voor virussen. In diermodellen, intracerebroventriculair (ICV), intraperitoneale, directe placenta en intraveneuze (IV) zijn infecties gebruikt voor de pathogenese van virale encefalitis bestuderen. ICV inoculatie met virus wordt vaak gebruikt om het centrale zenuwstelsel (CNS) infecties bij muizen vastgesteld. Studies met deze techniek melden wijdverspreide infectie, met name cellen in de periventriculaire gebieden en in gebieden van de hersenen in direct contact met de cerebrospinale vloeistof (CSF), similar de effecten van virale ventriculoencephalitis. De geringe omvang van adeno-geassocieerd virus (AAV) deeltjes (20 – 25 nm in diameter) vergemakkelijkt de verspreiding gehele hersenen ICV infecties 2-4. Intraperitoneale 5, directe placenta 6, en IV injecties 7 vertegenwoordigen hematogenic systemische toediening. De penetratie van virale deeltjes door de bloed-hersenbarrière (BBB) kunnen zij het parenchym van de hersenen neonatale bereikt, die diffuus microgliacellen knobbeltjes 8,9.
Cytomegalovirus (CMV) is een veel voorkomende virus dat behoort tot de herpes virus familie. In de Verenigde Staten, 50% – heeft 80% van de mensen CMV-infectie hadden door de leeftijd 40. CMV-infecties zijn zelden schadelijk, maar kan ziekten bij immuungecompromitteerde patiënten en foetussen veroorzaken. Van alle leveringen, 0,2% – 2% worden geboren met een CMV-10, wat resulteert in ernstige symptomen zoals microcefalie, periventriculaire verkalking, cerebellaire hypoplasie, microogontsteking, en de oogzenuw atrofie 11,12. Bovendien, mentale retardatie, perceptief gehoorverlies, visuele gebreken, beslaglegging, en epilepsie komen voor in ongeveer 10% van de niet-dodelijk-CMV-geïnfecteerde zuigelingen 13,14. CNS dysfunctie is de meest voorkomende kenmerkende symptoom van CMV aangeboren afwijking. Meer kinderen worden permanent elk jaar uitgeschakeld door congenitale CMV dan door het syndroom van Down, foetaal alcohol syndroom, of spina bifida 15. Er zijn geen vaccins tegen CMV beschikbaar op dit opgeroepen tot een behoefte aan een veilig en effectief vaccin. Het bestuderen van de interactie van CMV deeltjes met hun receptoren in de eerste fase van de infectie is belangrijk om het effect van vaccinatie begrijpen.
Ventriculoencephalitis en diffuse microglia knobbeltjes zijn de twee belangrijkste pathologische kenmerken van CMV encefalitis 16. Het is onzeker hoe de CMV deeltjes (150-300 nm) verspreid door de hersenen in de acute fase van de infectie eennd hoe de verdeling van cellulaire receptoren en hun affiniteit voor virussen dragen tot de virale verspreiding. Kawasaki et al. Geëvalueerd ICV en IV infecties vanuit de verdeling van deeltjes en hun receptoren (β1 integrine) in de eerste fase van de infectie. We hebben gevonden dat de verspreiding van CMV deeltjes en de expressie van β1 integrine goed gecorreleerd in de vroegste fase van de infectie in zowel ICV en IV infecties 8. ICV-infectie is een model van ventriculoencephalitis en IV-infectie is een model van diffuse microglia knobbeltjes. Het bestuderen van de dynamica van virale of fluorescerende deeltjes nuttige informatie opleveren over het effect van deeltjesgrootte, virale interacties met cellulaire receptoren, en het mechanisme van BBB penetratie in de hersenen geven. Het volgende protocol kan worden gebruikt om een virale infectie en virale vector in het CZS te onderzoeken.
Protocol
Representative Results
Discussion
In diermodellen, ICV, intraperitoneale, directe placenta en IV infecties zijn gebruikt om de pathogenese van virale encefalitis bestuderen. Gefocusseerd op het ICV en IV injectie modellen van neonatale muizen voor de eenvoud van de procedure en het voordeel van directe injectie van deeltjes in het doelgebied. Hoewel intraperitoneale infectie is een eenvoudige methode, virusdeeltjes verspreid systemisch via een indirect proces 5,24. Direct placenta infectie is een goede methode embryonale systemische infectie …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Mr. Masaaki Kaneta, Ms. Hiromi Suzuki, and Ms. Mitsue Kawashima (Department of Regenerative and Infectious Pathology, Hamamatsu University School of Medicine) for their excellent technical assistance. This work was supported by the Japan Society for the Promotion of Science, KAKENHI Grant Number 23590445.
Materials
| Tris; tris(hydroxymethyl)- aminomethane | Sigma-Aldrich | T-6791 | |
| HCl | Sigma-Aldrich | H-1758 | |
| pEGFP-N1 vector | Clontech | #6085-1 | |
| D-sorbitol | Sigma-Aldrich | S-1876 | |
| SPHERO TM Fluorescent Polystyrene Nile Red 0.04-0.06 | Spherotech, Inc. | FP-00556-2 | |
| SPHERO TM Fluorescent Polystyrene Nile Red 0.1-0.3 | Spherotech, Inc. | FP-0256-2 | |
| SPHERO TM Fluorescent Polystyrene Nile Red 1.7-2.2 | Spherotech, inc. | FP-2056-2 | |
| 10% mouse serum | DAKO | X0910 | |
| C57BL/6 mouse | SLC, Inc. | ||
| ICR mouse | SLC, Inc. | ||
| Modified Microliter Syringes (7000 Series) | Hamilton company | ||
| 35-gauge needle | Saito Medical | ||
| A Wee Sight Transilluminator | Phillips Healthcare | 1017920 | |
| O.C.T.Compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| RNase A | Sigma-Aldrich | R4642 | |
| Nonidet(R) P-40 | Nacalai | 25223-04 | |
| citrate buffer (pH6) x10 | Sigma-Aldrich | C9999-100ml | |
| pepsin | Sigma-Aldrich | P6887 | |
| EDTA | dojindo | N001 | |
| Formamide | TCI | F0045 | |
| Dextran sulfate sodium salt | Sigma-Aldrich | 42867-5G | |
| Denhardt's Solution (50X) | ThermoFishcer sceintific | 750018 | |
| Yeast tRNA (10 mg/mL) | ThermoFishcer sceintific | AM7119 | |
| SSC x20 | Sigma-Aldrich | S6639 | |
| DAPI | ThermoFishcer sceintific | D1306 | |
| n-Hexane | Sigma-Aldrich | 296090 | |
| superfrost plus glass | ThermoFishcer sceintific | 12-55-18 | |
| Cytokeep II | Nippon Shoji Co. | ||
| FITC-conjugated Griffonia simplicifolia isolectin B4 | Vector laboratories, Inc. | L1104 | |
| Anti-Mouse CD31 (PECAM-1) PE | ebioscience | 12-0311 | |
| ProLong Gold | ThermoFishcer sceintific | P36934 | |
| BIOREVO | KEYENCE | BZ-9000E | |
References
- Philippe, N., et al. Pandoraviruses: amoeba viruses with genomes up to 2.5 Mb reaching that of parasitic eukaryotes. Science. 341 (6143), 281-286 (2013).
- Passini, M. A., et al. Intraventricular brain injection of adeno-associated virus type 1 (AAV1) in neonatal mice results in complementary patterns of neuronal transduction to AAV2 and total long-term correction of storage lesions in the brains of beta-glucuronidase-deficient mice. J Virol. 77 (12), 7034-7040 (2003).
- Kim, J. Y., et al. Viral transduction of the neonatal brain delivers controllable genetic mosaicism for visualising and manipulating neuronal circuits in vivo. Eur J Neurosci. 37 (8), 1203-1220 (2013).
- McLean, J. R., et al. Widespread neuron-specific transgene expression in brain and spinal cord following synapsin promoter-driven AAV9 neonatal intracerebroventricular injection. Neurosci Lett. 576, 73-78 (2014).
- Hsu, K. M., Pratt, J. R., Akers, W. J., Achilefu, S. I., Yokoyama, W. M. Murine cytomegalovirus displays selective infection of cells within hours after systemic administration. J Gen Virol. 90. 90 (Pt 1), 33-43 (2009).
- Sakao-Suzuki, M., et al. Aberrant fetal macrophage/microglial reactions to cytomegalovirus infection. Annals of Clinical and Translational Neruology. 1 (8), 570-588 (2014).
- Gombash Lampe, S. E., Kaspar, B. K., Foust, K. D. Intravenous injections in neonatal mice. J Vis Exp. (93), e52037 (2014).
- Kawasaki, H., et al. Cytomegalovirus initiates infection selectively from high-level beta1 integrin-expressing cells in the brain. Am J Pathol. 185 (5), 1304-1323 (2015).
- Rahim, A. A., et al. Intravenous administration of AAV2/9 to the fetal and neonatal mouse leads to differential targeting of CNS cell types and extensive transduction of the nervous system. FASEB J. 25 (10), 3505-3518 (2011).
- Cannon, M. J., Davis, K. F. Washing our hands of the congenital cytomegalovirus disease epidemic. Bmc Public Health. 5, (2005).
- Frenkel, L. D., Keys, M. P., Hefferen, S. J., Rola-Pleszczynski, M., Bellanti, J. A. Unusual eye abnormalities associated with congenital cytomegalovirus infection. Pediatrics. 66 (5), 763-766 (1980).
- Becroft, D. M. Prenatal cytomegalovirus infection: epidemiology, pathology and pathogenesis. Perspect Pediatr Pathol. 6, 203-241 (1981).
- Conboy, T. J., et al. Intellectual development in school-aged children with asymptomatic congenital cytomegalovirus infection. Pediatrics. 77 (6), 801-806 (1986).
- Fowler, K. B., et al. The outcome of congenital cytomegalovirus infection in relation to maternal antibody status. N Engl J Med. 326 (10), 663-667 (1992).
- Cannon, M. J. Congenital cytomegalovirus (CMV) epidemiology and awareness. J Clin Virol. 46 Suppl 4, S6-S10 (2009).
- Grassi, M. P., et al. Microglial nodular encephalitis and ventriculoencephalitis due to cytomegalovirus infection in patients with AIDS: two distinct clinical patterns. Clin Infect Dis. 27 (3), 504-508 (1998).
- Kawasaki, H., Mocarski, E. S., Kosugi, I., Tsutsui, Y. Cyclosporine inhibits mouse cytomegalovirus infection via a cyclophilin-dependent pathway specifically in neural stem/progenitor cells. J Virol. 81 (17), 9013-9023 (2007).
- Britt, W. J. Human cytomegalovirus: propagation, quantification, and storage. Curr Protoc Microbiol. Chapter 14, Unit 14E 13 (2010).
- Kawasaki, H., Kosugi, I., Arai, Y., Iwashita, T., Tsutsui, Y. Mouse embryonic stem cells inhibit murine cytomegalovirus infection through a multi-step process. PLoS One. 6 (3), e17492 (2011).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. (65), (2012).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Cutting sections of paraffin-embedded tissues. CSH Protoc. , (2008).
- Chi, V., Chandy, K. G. Immunohistochemistry: paraffin sections using the Vectastain ABC kit from vector labs. J Vis Exp. (8), e308 (2007).
- Wilsbacher, L. D., Coughlin, S. R. Analysis of cardiomyocyte development using immunofluorescence in embryonic mouse heart. J Vis Exp. (97), (2015).
- Ohshima, M., et al. Intraperitoneal and intravenous deliveries are not comparable in terms of drug efficacy and cell distribution in neonatal mice with hypoxia-ischemia. Brain Dev. 37 (4), 376-386 (2015).
- Kim, J. Y., Grunke, S. D., Levites, Y., Golde, T. E., Jankowsky, J. L. Intracerebroventricular viral injection of the neonatal mouse brain for persistent and widespread neuronal transduction. J Vis Exp. (91), e51863 (2014).
- Glascock, J. J., et al. Delivery of therapeutic agents through intracerebroventricular (ICV) and intravenous (IV) injection in mice. J Vis Exp. (56), (2011).
