新生児の脳へのウイルス粒子と蛍光マイクロビーズの脳室内および血管内注入
Summary
Here, we describe a simple method of intracerebroventricular and intravascular injection of viral particles or fluorescent microbeads into the neonatal mouse brain. The localization pattern of the virus and nanoparticles could be detected by microscopic evaluation or by in situ hybridization.
Abstract
ウイルス性脳炎の病因に関する研究では、感染症法が重要です。脳への2つの主な感染経路の最初のは、脳の血管内皮細胞と周皮細胞の感染を伴う血行性経路、です。第二は、脳室内（ICV）ルートです。いったん中枢神経系（CNS）内で、ウイルスは脳脊髄液を介してくも膜下腔、髄膜、および脈絡叢に拡散する可能性があります。実験モデルでは、CNSのウイルス分布の初期段階では十分に特徴付けされていない、そして特定の細胞が最初に感染しているかどうかは不明です。ここでは、感染の急性期サイトメガロウイルス（CMV）の粒子の分布を分析し、新生児マウスの脳にICVまたは血管内（IV）注射の後、一次ウイルス血症と呼ばれます。 ICV注入モデルでは、マウスCMV（MCMV）、または蛍光マイクロビーズの5μlをmidpoiで側脳室に注入しましたntの27 G針を10μlのシリンジを使用して、耳と目の間。 IV注入モデルでは、35 G針を1 mlの注射器を使用しました。トランスイルミネーターは、新生児マウスの浅側頭（顔）静脈を可視化するために使用されました。私たちは、浅側頭静脈にMCMVまたは蛍光マイクロビーズの50μLを注入しました。脳を異なる時点注射後に回収しました。 MCMVゲノムは、in situハイブリダイゼーション法において使用して検出しました。組換えMCMV粒子を発現する蛍光マイクロビーズまたは緑色蛍光タンパク質を蛍光顕微鏡で観察しました。これらの技術は、脳炎の病因を研究するために、多くの他の病原体にも適用することができます。
Introduction
ウイルス性脳炎を研究する際に、ウイルス粒子の最初の分布は、疾患の病因を理解し、脳内のウイルスの標的を同定することが非常に重要です。パンドラウイルス属は、サイズが1以上700 nmであるが、ほとんどのウイルスは、20〜300nm程度の大きさの範囲。感染の急性期におけるウイルス粒子の分布は、粒子の大きさ、細胞受容体の分布、またはウイルスの細胞受容体の親和性に依存し得ます。動物モデル、脳室内（ICV）で、腹腔内、直接胎盤、および静脈内（IV）感染症は、ウイルス性脳炎の病因を研究するために使用されてきました。ウイルスのICV接種は、多くの場合、中枢神経系（CNS）のマウスにおける感染を確立するために使用されます。この技術を用いた研究は、特に脳室周囲のゾーン内の細胞および脳脊髄液（CSF）、similaと直接接触している脳の領域において、広範な感染が報告しますウイルスventriculoencephalitisの影響にrを。アデノ随伴ウイルス（AAV）粒子の小さいサイズ（20 -直径25 nm）はICV感染2-4の脳全体にその普及を促進します。腹腔内5、直接胎盤6、およびIV注射7は、造血全身投与を表します。血液脳関門（BBB）を介してウイルス粒子の侵入は、それらが拡散ミクログリア結節8,9を表し、新生児の脳の柔組織に到達することを可能にします。
サイトメガロウイルス（CMV）は、ヘルペスウイルスファミリーに属する一般的なウイルスです。米国では、50％ – 人の80％が年齢によってCMV感染があった40 CMV感染はまれに有害であるが、免疫不全患者や胎児疾患を引き起こす可能性があります。すべての配送のうち、0.2％ – 2％は、小頭症、脳室周囲石灰化、小脳形成不全、MICRなどの重篤な症状で、その結果、CMV 10を持って生まれています眼炎、視神経萎縮11,12。また、精神遅滞、感音難聴、視覚障害、発作、およびてんかんは非致命的CMV感染の乳児13,14の約10％に起こります。中枢神経系の機能不全は、CMV先天異常の最も一般的な特徴症状です。より多くの子供たちが永久にダウン症候群、胎児性アルコール症候群、または二分脊椎15よりも、先天性CMVが毎年無効になっています。現時点で入手可能なCMVに対しては予防接種は、安全かつ有効なワクチンの必要性を呼びかけ、ありません。感染の初期段階でそれらの受容体とCMV粒子の相互作用を研究することは、ワクチン接種の効果を理解することが重要です。
Ventriculoencephalitisとミクログリアの結節を拡散は、CMV脳炎16の二つの主要な病理学的特徴です。 （ – 300から150nm）感染aの急性期に脳を介して広がるCMV粒子がどのようにそれは不確かされていますndはどのように細胞受容体の分布やウイルスに対するそれらの親和性は、ウイルスの普及に貢献しています。川崎らは 、感染の初期段階での粒子およびその受容体の分布（β1インテグリン）の観点から、ICVおよびIV感染を評価しました。我々は、CMV粒子の普及とβ1インテグリンの発現がICVおよびIV感染8の両方で感染の初期段階ではよく相関していることを発見しました。 ICV感染はventriculoencephalitisのモデルであり、IV感染が拡散ミクログリア結節のモデルです。ウイルスや蛍光粒子のダイナミクスを研究することは、粒子サイズ、細胞受容体とウイルスの相互作用、および脳内のBBB透過のメカニズムの影響に関する有用な情報を与えるだろう。以下のプロトコルは、CNS内の任意のウイルス感染およびウイルスベクターを調査するために使用することができます。
Protocol
Representative Results
Discussion
動物モデルでは、ICV、腹腔内、直接胎盤、およびIV感染症はウイルス性脳炎の病因を研究するために使用されてきました。私たちは、手続きの簡単さと標的領域への粒子の直接注入の利益のために新生児マウスのICVおよびIV注入モデルに焦点を当てました。腹腔内感染が容易な方法であるが、ウイルス粒子は、間接的なプロセス5,24を介して全身に広がります。ダイレクト胎盤感染…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Mr. Masaaki Kaneta, Ms. Hiromi Suzuki, and Ms. Mitsue Kawashima (Department of Regenerative and Infectious Pathology, Hamamatsu University School of Medicine) for their excellent technical assistance. This work was supported by the Japan Society for the Promotion of Science, KAKENHI Grant Number 23590445.
Materials
| Tris; tris(hydroxymethyl)- aminomethane | Sigma-Aldrich | T-6791 | |
| HCl | Sigma-Aldrich | H-1758 | |
| pEGFP-N1 vector | Clontech | #6085-1 | |
| D-sorbitol | Sigma-Aldrich | S-1876 | |
| SPHERO TM Fluorescent Polystyrene Nile Red 0.04-0.06 | Spherotech, Inc. | FP-00556-2 | |
| SPHERO TM Fluorescent Polystyrene Nile Red 0.1-0.3 | Spherotech, Inc. | FP-0256-2 | |
| SPHERO TM Fluorescent Polystyrene Nile Red 1.7-2.2 | Spherotech, inc. | FP-2056-2 | |
| 10% mouse serum | DAKO | X0910 | |
| C57BL/6 mouse | SLC, Inc. | ||
| ICR mouse | SLC, Inc. | ||
| Modified Microliter Syringes (7000 Series) | Hamilton company | ||
| 35-gauge needle | Saito Medical | ||
| A Wee Sight Transilluminator | Phillips Healthcare | 1017920 | |
| O.C.T.Compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| RNase A | Sigma-Aldrich | R4642 | |
| Nonidet(R) P-40 | Nacalai | 25223-04 | |
| citrate buffer (pH6) x10 | Sigma-Aldrich | C9999-100ml | |
| pepsin | Sigma-Aldrich | P6887 | |
| EDTA | dojindo | N001 | |
| Formamide | TCI | F0045 | |
| Dextran sulfate sodium salt | Sigma-Aldrich | 42867-5G | |
| Denhardt's Solution (50X) | ThermoFishcer sceintific | 750018 | |
| Yeast tRNA (10 mg/mL) | ThermoFishcer sceintific | AM7119 | |
| SSC x20 | Sigma-Aldrich | S6639 | |
| DAPI | ThermoFishcer sceintific | D1306 | |
| n-Hexane | Sigma-Aldrich | 296090 | |
| superfrost plus glass | ThermoFishcer sceintific | 12-55-18 | |
| Cytokeep II | Nippon Shoji Co. | ||
| FITC-conjugated Griffonia simplicifolia isolectin B4 | Vector laboratories, Inc. | L1104 | |
| Anti-Mouse CD31 (PECAM-1) PE | ebioscience | 12-0311 | |
| ProLong Gold | ThermoFishcer sceintific | P36934 | |
| BIOREVO | KEYENCE | BZ-9000E | |
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