Intracerebroventricular e intravascular A injeção de Viral partículas e fluorescentes microesferas no cérebro Neonatal

Summary

Here, we describe a simple method of intracerebroventricular and intravascular injection of viral particles or fluorescent microbeads into the neonatal mouse brain. The localization pattern of the virus and nanoparticles could be detected by microscopic evaluation or by in situ hybridization.

Abstract

No estudo sobre a patogénese de encefalite viral, o método de infecção é crítica. A primeira das duas principais vias infecciosos para o cérebro é o percurso hemática, que envolve a infecção de células endoteliais e pericitos do cérebro. O segundo é o intracerebroventricular (ICV) de rota. Uma vez dentro do sistema nervoso central (SNC), os vírus podem espalhar-se para o espaço subaracnóide, meninges, plexo coróide e através do líquido cefalorraquidiano. Em modelos experimentais, os primeiros estágios da distribuição viral CNS não estão bem caracterizados, e não está claro se apenas algumas células são inicialmente infectado. Aqui, foi analisada a distribuição de partículas de citomegalovírus (CMV) durante a fase aguda da infecção, denominado viremia primária, seguindo ICV ou intravascular (IV) injecção no cérebro neonatal de rato. No modelo de injecção ICV, 5 ul de CMV de murino (MCMV) ou microesferas fluorescentes foram injectadas no ventrículo lateral na midpoint entre a orelha e o olho, utilizando uma seringa de 10 mL com uma agulha de 27 G. No modelo de injecção IV, foi usada uma seringa de 1 ml com uma agulha de 35 g. Um transiluminador foi usado para visualizar a veia temporal superficial (facial) do rato neonatal. Nós infundido 50 ul de microesferas fluorescentes ou MCMV na veia temporal superficial. Os cérebros foram colhidas em diferentes pontos de tempo após a injecção. Genomas MCMV foram detectados usando o método de hibridação in situ. microesferas fluorescentes ou proteína verde fluorescente que expressam partículas MCMV recombinantes foram observadas por microscopia fluorescente. Estas técnicas podem ser aplicadas a vários outros agentes patogénicos para investigar a patogénese da encefalite.

Introduction

Ao estudar a encefalite virai, a distribuição inicial de partículas virais é muito importante para compreender patogênese da doença e para identificar alvos virais no cérebro. A maioria dos vírus variam em tamanho de 20 a 300 nm, embora o pandoravírus é mais do que 700 nm de tamanho ^1. A distribuição das partículas virais na fase aguda da infecção podem depender do tamanho das partículas, a distribuição de receptores celulares, ou a afinidade dos receptores celulares para os vírus. Em modelos animais, intracerebroventricular (ICV), intraperitoneal, placenta directa, e intravenosa (IV), as infecções foram utilizados para estudar a patogénese da encefalite viral. ICV inoculação com vírus é muitas vezes usado para estabelecer infecções centrais do sistema nervoso (CNS) em camundongos. Estudos utilizando esta técnica relatam infecção generalizada, particularmente de células nas zonas peri e em regiões do cérebro em contato direto com o líquido cefalorraquidiano (LCR), Similar para os efeitos da ventriculoencephalitis viral. O pequeno tamanho de vírus adeno-associado (AAV) partículas (de 20 – 25 nm de diâmetro) facilita a sua disseminação em todo o cérebro em infecções ICV ^2-4. Intraperitoneal ^5, placentários direta ⁶ e IV injeções ⁷ representam administração sistêmica hematogênica. A penetração das partículas virais através da barreira sangue-cérebro (BBB) ​​permite-lhes alcançar o parênquima do cérebro neonatal, representando nódulos microgliais difusas ^8,9.

Citomegalovírus (CMV) é um vírus comum, que pertence à família do vírus do herpes. Nos Estados Unidos, 50% – 80% das pessoas tiveram a infecção por CMV pela idade 40. infecções por CMV raramente são prejudiciais, mas podem causar doenças em pacientes imunocomprometidos e fetos. De todos os partos, 0,2% – 2% nascem com CMV ^10, resultando em sintomas graves como microcefalia, calcificações periventricular, hipoplasia cerebelar, microftalmia, e atrofia do nervo óptico ^11,12. Além disso, retardo mental, perda auditiva neurossensorial, defeitos visuais, convulsões e epilepsia ocorrem em cerca de 10% das crianças infectadas com CMV não fatalmente ^13,14. disfunção do SNC é o sintoma característico mais comum de CMV anomalia congênita. Mais crianças estão permanentemente desativado cada ano por CMV congênita que pela síndrome de Down, síndrome alcoólica fetal, ou espinha bífida ^15. Não há vacinas contra a CMV disponíveis no presente, apelando para a necessidade de uma vacina segura e eficaz. Estudar a interacção de partículas de CMV com os seus receptores na fase mais inicial da infecção é importante para compreender o efeito da vacinação.

Ventriculoencephalitis e nódulos microgliais difusas são as duas principais características patológicas da CMV encefalite ^16. Tem sido incerto como as partículas de CMV (150-300 nm), distribuídos através do cérebro na fase aguda da infecção umND como a distribuição de receptores celulares e a sua afinidade para os vírus contribuir para a propagação virai. Kawasaki et al. Avaliaram ICV e IV infecções do ponto de vista da distribuição de partículas e os seus receptores (integrina β1) na fase inicial da infecção. Descobrimos que a disseminação de partículas CMV e a expressão de integrina β1 estão bem correlacionados numa fase mais inicial da infecção, tanto ICV e infecções IV ^8. infecção ICV é um modelo de ventriculoencephalitis e infecção IV é um modelo de nódulos microgliais difusas. O estudo da dinâmica de partículas virais ou fluorescentes daria informações úteis sobre o efeito do tamanho de partícula, as interacções virais com receptores celulares, e o mecanismo de certificação penetração no cérebro. O protocolo seguinte pode ser utilizado para investigar qualquer infecção viral e vetor viral no sistema nervoso central.

Protocol

Todos os protocolos experimentais foram aprovados pelo Comitê de Cuidados Animais da Universidade Hamamatsu da School of Medicine. 1. Preparação de MCMV (Smith estirpe) e recombinante M32-enhanced green fluorescent protein (EGFP) -MCMV Gerar recombinante M32-EGFP-MCMV de acordo com o método como se segue (1,2-1,9), e como anteriormente descrito 8. Use vírus recombinantes derivadas da estirpe Smith de wild-tipo MCMV (número de acesso: U68299). Inserir EGF…

Representative Results

Em estudos sobre a patogénese da encefalite viral, o método de infecção é importante. A via hemática representa uma infecção aguda das células endoteliais e pericitos do cérebro, enquanto o percurso ICV representa uma infecção aguda propagação através do LCR através do espaço subaracnóide, alcançando as meninges e plexo coróide. Para analisar a primeira distribuição de partículas em encefalite aguda, hibridização in situ a detecção dos genomas MCMV e o…

Discussion

Em modelos animais, ICV, intraperitoneal, placentária directa, infecções e IV têm sido utilizados para estudar a patogénese da encefalite viral. Estamos focados em modelos ICV e injeção IV de ratos neonatal para a simplicidade dos procedimentos e os benefícios da injeção direta de partículas para a região de destino. Embora a infecção intraperitoneal é um método fácil, partículas virais espalhados sistemicamente através de um processo de ^5,24 indireta. infecção placentária Direct é um b…

Materials

Tris; tris(hydroxymethyl)- aminomethane	Sigma-Aldrich	T-6791
HCl	Sigma-Aldrich	H-1758
pEGFP-N1 vector	Clontech	#6085-1
D-sorbitol	Sigma-Aldrich	S-1876
SPHERO TM Fluorescent Polystyrene Nile Red 0.04-0.06	Spherotech, Inc.	FP-00556-2
SPHERO TM Fluorescent Polystyrene Nile Red 0.1-0.3	Spherotech, Inc.	FP-0256-2
SPHERO TM Fluorescent Polystyrene Nile Red 1.7-2.2	Spherotech, inc.	FP-2056-2
10% mouse serum	DAKO	X0910
C57BL/6 mouse	SLC, Inc.
ICR mouse	SLC, Inc.
Modified Microliter Syringes (7000 Series)	Hamilton company
35-gauge needle	Saito Medical
A Wee Sight Transilluminator	Phillips Healthcare	1017920
O.C.T.Compound	Sakura Finetek	4583
RNase A	Sigma-Aldrich	R4642
Nonidet(R) P-40	Nacalai	25223-04
citrate buffer (pH6) x10	Sigma-Aldrich	C9999-100ml
pepsin	Sigma-Aldrich	P6887
EDTA	dojindo	N001
Formamide	TCI	F0045
Dextran sulfate sodium salt	Sigma-Aldrich	42867-5G
Denhardt's Solution (50X)	ThermoFishcer sceintific	750018
Yeast tRNA (10 mg/mL)	ThermoFishcer sceintific	AM7119
SSC x20	Sigma-Aldrich	S6639
DAPI	ThermoFishcer sceintific	D1306
n-Hexane	Sigma-Aldrich	296090
superfrost plus glass	ThermoFishcer sceintific	12-55-18
Cytokeep II	Nippon Shoji Co.
FITC-conjugated Griffonia simplicifolia isolectin B4	Vector laboratories, Inc.	L1104
Anti-Mouse CD31 (PECAM-1) PE	ebioscience	12-0311
ProLong  Gold	ThermoFishcer sceintific	P36934
BIOREVO	KEYENCE	BZ-9000E