Intracerebroventricular e intravascolare Iniezione di Viral particelle e fluorescenti microperle nel cervello neonatale
Summary
Here, we describe a simple method of intracerebroventricular and intravascular injection of viral particles or fluorescent microbeads into the neonatal mouse brain. The localization pattern of the virus and nanoparticles could be detected by microscopic evaluation or by in situ hybridization.
Abstract
Nello studio sulla patogenesi di encefalite virale, il metodo infezione è critica. La prima delle due principali vie infettive al cervello è la via ematogena, che coinvolge l'infezione delle cellule endoteliali e periciti del cervello. Il secondo è il intracerebroventricolare (ICV) percorso. Una volta all'interno del sistema nervoso centrale (CNS), i virus possono diffondersi nello spazio subaracnoideo, meningi, e plesso coroideo attraverso il fluido cerebrospinale. In modelli sperimentali, le prime fasi di distribuzione virale del sistema nervoso centrale non sono ben caratterizzati, e non è chiaro se solo alcune cellule infettate sono inizialmente. Qui, abbiamo analizzato la distribuzione del citomegalovirus (CMV) particelle durante la fase acuta dell'infezione, chiamato viremia primaria, seguendo ICV o intravascolare (IV) iniezione nel cervello neonatale mouse. Nel modello di iniezione ICV, 5 ml di murino CMV (MCMV) o microsfere fluorescenti sono stati iniettati nel ventricolo laterale al midpoint tra l'orecchio e l'occhio utilizzando una siringa da 10 microlitri con un ago 27 G. Nel modello di iniezione IV, è stata utilizzata una siringa da 1 ml con un ago 35 G. Un transilluminatore stato usato per visualizzare temporale (facciale) vena superficiale del mouse neonatale. Abbiamo infuso 50 ml di MCMV o microsfere fluorescenti nella vena temporale superficiale. Brains sono state raccolte in diversi momenti dopo l'iniezione. Genomi MCMV sono stati rilevati utilizzando il metodo di ibridazione in situ. microsfere fluorescenti o proteina verde fluorescente che esprimono particelle MCMV ricombinanti sono stati osservati al microscopio a fluorescenza. Queste tecniche possono essere applicate a molti altri patogeni per studiare la patogenesi di encefalite.
Introduction
Studiando encefalite virale, la distribuzione iniziale di particelle virali è molto importante per comprendere patogenesi della malattia e per identificare bersagli virali nel cervello. Maggior parte dei virus variano in dimensioni da 20 a 300 nm, sebbene il pandoravirus è superiore a 700 nm di dimensione 1. La distribuzione delle particelle virali in fase acuta dell'infezione può dipendere dalla dimensione delle particelle, la distribuzione dei recettori cellulari, o l'affinità dei recettori cellulari di virus. In modelli animali, intracerebroventricolare (ICV), intraperitoneale, placentari diretta, e per via endovenosa (IV) le infezioni sono state usate per studiare la patogenesi di encefalite virale. ICV inoculazione con il virus viene spesso utilizzato per stabilire le infezioni del sistema nervoso centrale (CNS) nei topi. Gli studi che utilizzano questa tecnica riportano infezione diffusa, in particolare delle cellule nelle zone periventricolari e nelle regioni del cervello in diretto contatto con il liquido cerebrospinale (CSF), similar agli effetti ventriculoencephalitis virale. Le piccole dimensioni del virus adeno-associato (AAV) particelle (20 – 25 nm di diametro) facilita la loro diffusione in tutto il cervello nelle infezioni ICV 2-4. Intraperitoneale 5, placentari diretta 6, e IV iniezioni 7 rappresentano la somministrazione sistemica hematogenic. La penetrazione delle particelle virali attraverso la barriera emato-encefalica (BBB) consente di raggiungere il parenchima cerebrale neonatale, rappresentando diffuse noduli microgliali 8,9.
Citomegalovirus (CMV) è un virus comune che appartiene alla famiglia herpes virus. Negli Stati Uniti, il 50% – 80% delle persone hanno avuto infezione da CMV per età 40. infezioni da CMV raramente sono dannosi, ma possono causare malattie nei pazienti immunocompromessi e feti. Di tutte le consegne, 0,2% – 2% sono nati con CMV 10, con conseguente sintomi gravi, come la microcefalia, calcificazioni periventricolare, ipoplasia cerebellare, microftalmia, e del nervo ottico atrofia 11,12. Inoltre, il ritardo mentale, sordità neurosensoriale, difetti visivi, convulsioni ed epilessia si verificano in circa il 10% dei non-fatalmente neonati CMV-infettati 13,14. CNS erettile è il sintomo caratteristico più comune di CMV anomalia congenita. Più i bambini sono permanentemente disabilitati ogni anno da CMV congenito che da sindrome di Down, la sindrome alcolica fetale, o spina bifida 15. Non ci sono vaccinazioni contro CMV disponibile al momento attuale, chiedendo la necessità di un vaccino sicuro ed efficace. Studiando l'interazione di particelle CMV con i loro recettori nella primissima fase di infezione è importante capire l'effetto della vaccinazione.
Ventriculoencephalitis e noduli microgliali diffuse sono le due principali caratteristiche patologiche di CMV Encefalite 16. E 'stato chiaro come le particelle CMV (150 – 300 nm) diffondono attraverso il cervello nella fase acuta dell'infezione unnd come la distribuzione dei recettori cellulari e la loro affinità per i virus contribuiscono alla diffusione virale. Kawasaki et al. Hanno valutato ICV e IV infezioni dal punto di vista della distribuzione delle particelle e dei loro recettori (β1 integrine) nella fase più antica di infezione. Abbiamo scoperto che la diffusione di particelle CMV e l'espressione di β1 integrina sono ben correlata nella primissima fase di infezione sia ICV e le infezioni IV 8. infezione ICV è un modello di ventriculoencephalitis e l'infezione IV è un modello di noduli microgliali diffuse. Studiando le dinamiche di particelle virali o fluorescenti darebbe utili informazioni sull'effetto della dimensione delle particelle, interazioni virali con recettori cellulari, e il meccanismo di penetrazione BBB nel cervello. Il seguente protocollo potrebbe essere utilizzato per studiare qualsiasi infezione virale e vettore virale nel SNC.
Protocol
Representative Results
Discussion
In modelli animali, ICV, intraperitoneale, placentare diretta e infezioni IV sono stati utilizzati per studiare la patogenesi di encefalite virale. Ci siamo concentrati sui modelli ICV ed iniezione IV di topi neonatale per la semplicità delle procedure e il beneficio di iniezione diretta di particelle nella regione di destinazione. Anche se l'infezione intraperitoneale è un metodo facile, particelle virali diffuse sistemica attraverso un processo indiretto 5,24. un'infezione placentare Direct è un …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Mr. Masaaki Kaneta, Ms. Hiromi Suzuki, and Ms. Mitsue Kawashima (Department of Regenerative and Infectious Pathology, Hamamatsu University School of Medicine) for their excellent technical assistance. This work was supported by the Japan Society for the Promotion of Science, KAKENHI Grant Number 23590445.
Materials
| Tris; tris(hydroxymethyl)- aminomethane | Sigma-Aldrich | T-6791 | |
| HCl | Sigma-Aldrich | H-1758 | |
| pEGFP-N1 vector | Clontech | #6085-1 | |
| D-sorbitol | Sigma-Aldrich | S-1876 | |
| SPHERO TM Fluorescent Polystyrene Nile Red 0.04-0.06 | Spherotech, Inc. | FP-00556-2 | |
| SPHERO TM Fluorescent Polystyrene Nile Red 0.1-0.3 | Spherotech, Inc. | FP-0256-2 | |
| SPHERO TM Fluorescent Polystyrene Nile Red 1.7-2.2 | Spherotech, inc. | FP-2056-2 | |
| 10% mouse serum | DAKO | X0910 | |
| C57BL/6 mouse | SLC, Inc. | ||
| ICR mouse | SLC, Inc. | ||
| Modified Microliter Syringes (7000 Series) | Hamilton company | ||
| 35-gauge needle | Saito Medical | ||
| A Wee Sight Transilluminator | Phillips Healthcare | 1017920 | |
| O.C.T.Compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| RNase A | Sigma-Aldrich | R4642 | |
| Nonidet(R) P-40 | Nacalai | 25223-04 | |
| citrate buffer (pH6) x10 | Sigma-Aldrich | C9999-100ml | |
| pepsin | Sigma-Aldrich | P6887 | |
| EDTA | dojindo | N001 | |
| Formamide | TCI | F0045 | |
| Dextran sulfate sodium salt | Sigma-Aldrich | 42867-5G | |
| Denhardt's Solution (50X) | ThermoFishcer sceintific | 750018 | |
| Yeast tRNA (10 mg/mL) | ThermoFishcer sceintific | AM7119 | |
| SSC x20 | Sigma-Aldrich | S6639 | |
| DAPI | ThermoFishcer sceintific | D1306 | |
| n-Hexane | Sigma-Aldrich | 296090 | |
| superfrost plus glass | ThermoFishcer sceintific | 12-55-18 | |
| Cytokeep II | Nippon Shoji Co. | ||
| FITC-conjugated Griffonia simplicifolia isolectin B4 | Vector laboratories, Inc. | L1104 | |
| Anti-Mouse CD31 (PECAM-1) PE | ebioscience | 12-0311 | |
| ProLong Gold | ThermoFishcer sceintific | P36934 | |
| BIOREVO | KEYENCE | BZ-9000E | |
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