Intracerebroventrikulær og intravaskulær injektion af viruspartikler og fluorescerende Microbeads ind i Neonatal Brain
Summary
Here, we describe a simple method of intracerebroventricular and intravascular injection of viral particles or fluorescent microbeads into the neonatal mouse brain. The localization pattern of the virus and nanoparticles could be detected by microscopic evaluation or by in situ hybridization.
Abstract
I undersøgelsen om patogenesen af virale encephalitis, infektionen metoden er kritisk. Den første af de to vigtigste smitsomme ruter til hjernen er den hæmatogen rute, som indebærer infektion af endotelceller og pericytter i hjernen. Det andet er intracerebroventrikulær (ICV) rute. Gang inden for det centrale nervesystem (CNS), kan virus spredes til subarachnoidealrummet, hjernehinderne, og choroid plexus via cerebrospinalvæsken. I eksperimentelle modeller, er de tidligste stadier af CNS viral fordeling ikke godt karakteriseret, og det er uklart, om kun bestemte celler oprindeligt er inficeret. Her har vi analyseret fordelingen af cytomegalovirus (CMV) partikler under den akutte fase af infektion, betegnet primære viræmi, efter ICV eller intravaskulær (IV) injektion i neonatal musehjerne. I ICV injektion model blev 5 pi murin CMV (MCMV) eller fluorescerende mikroperler injiceret i den laterale ventrikel ved midpoint mellem øret og øjet under anvendelse af en 10-pi sprøjte med en 27 G nål. I IV injektion model, blev en 1 ml sprøjte med en 35 G nål anvendes. En transilluminator blev anvendt til at visualisere den overfladiske temporale (facial) vene i neonatale mus. Vi infused 50 pi MCMV eller fluorescerende mikroperler i den overfladiske temporale vene. Hjerner blev høstet på forskellige tidspunkter efter injektion. MCMV genomer blev påvist under anvendelse af in situ hybridisering metode. Fluorescerende mikroperler eller grønt fluorescerende protein udtrykker rekombinante MCMV partikler blev observeret af fluorescensmikroskopi. Disse teknikker kan anvendes på mange andre patogener til at undersøge patogenesen af encephalitis.
Introduction
Når man studerer viral encephalitis, den indledende fordeling af viruspartikler er meget vigtigt at forstå sygdommen patogenese og identificere virale mål i hjernen. De fleste vira varierer i størrelse fra 20 til 300 nm, selv om pandoravirus er mere end 700 nm i størrelse 1. Fordelingen af de virale partikler i den akutte fase af infektion kan afhænge af størrelsen af partiklerne, fordelingen af cellulære receptorer eller affiniteten af de cellulære receptorer for virus. I dyremodeller, intracerebroventrikulær (ICV), intraperitoneal, direkte placenta, og intravenøs (IV) infektioner er blevet anvendt til at studere patogenesen af virale encephalitis. ICV inokulation med virus bruges ofte til at oprette centrale nervesystem (CNS) infektioner i mus. Undersøgelser ved hjælp af denne teknik rapporterer udbredt infektion, især af celler i periventrikulære zoner og i områder af hjernen i direkte kontakt med cerebrospinalvæske (CSF), Similar over for virkningerne af viral ventriculoencephalitis. Den lille størrelse af adenoassocieret virus (AAV) partikler (20 – 25 Nm i diameter) letter deres udbredelse i hele hjernen i ICV infektioner 2-4. Intraperitoneale 5, direkte placenta 6, og IV injektioner 7 repræsenterer hematogenic systemisk administration. Indtrængen af viruspartikler gennem blod-hjerne-barrieren (BBB) tillader dem at nå parenkym af neonatal hjerne, svarende diffuse mikrogliaceller knuder 8,9.
Cytomegalovirus (CMV) er en almindelig virus, der hører til herpes virus-familien. I USA, 50% – har 80% af de mennesker havde CMV-infektion efter alder 40. CMV-infektioner er sjældent skadeligt, men kan forårsage sygdomme hos immunkompromitterede patienter og fostre. Af alle leverancer, 0,2% – er 2% født med CMV 10, hvilket resulterer i alvorlige symptomer såsom microcephaly, periventricular forkalkning, cerebellar hypoplasi, microphthalmitis, og synsnerven atrofi 11,12. Desuden opstår mental retardering, sensorineuralt høretab, visuelle defekter, beslaglæggelse, og epilepsi i omkring 10% af ikke-dødeligt CMV-inficerede spædbørn 13,14. CNS-dysfunktion er den mest almindelige karakteristiske symptomer på CMV medfødt anomali. Flere børn er permanent deaktiveret hvert år af medfødt CMV end ved Downs syndrom, føtalt alkoholsyndrom eller rygmarvsbrok 15. Der er ikke blevet vaccineret mod CMV rådighed på nuværende tidspunkt, der opfordrer til et behov for en sikker og effektiv vaccine. Studer interaktionen af CMV-partikler med deres receptorer i den tidligste fase af infektion er vigtigt at forstå virkningen af vaccination.
Ventriculoencephalitis og diffuse microgliale knuder er de to vigtigste patologiske karakteristika CMV encephalitis 16. Det har været usikkert, hvordan de CMV-partikler (150 – 300 nm) spredes gennem hjernen i den akutte fase af infektion and hvordan fordelingen af cellulære receptorer og deres affinitet for vira bidrager til viral spredning. Kawasaki et al. Har evalueret ICV og IV infektioner fra perspektivet af fordelingen af partikler og deres receptorer (β1 integrin) i den tidligste fase af infektion. Vi har fundet, at formidling af CMV partikler og udtryk for β1 integrin er godt korreleret i den tidligste fase af infektion i både ICV og IV infektioner 8. ICV-infektion er en model af ventriculoencephalitis og IV infektion er en model af diffuse microgliale knuder. Studer dynamik virale eller fluorescerende partikler ville give nyttige oplysninger om virkningen af partikelstørrelse, virale interaktioner med cellulære receptorer, og mekanismen for BBB penetration i hjernen. Følgende protokol kan anvendes til at undersøge enhver viral infektion og viral vektor i CNS.
Protocol
Representative Results
Discussion
I dyremodeller, ICV, intraperitoneale, direkte placenta og IV infektioner er blevet anvendt til at undersøge patogenesen af virale encephalitis. Vi fokuserede på ICV og IV injektion modeller af neonatale mus til enkelheden af procedurerne og fordelen ved direkte injektion af partikler ind i målområdet. Selvom intraperitoneal infektion er en nem metode, viruspartikler spredes systemisk via en indirekte proces 5,24. Direkte placenta infektion er en god metode til at studere embryonale systemisk …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Mr. Masaaki Kaneta, Ms. Hiromi Suzuki, and Ms. Mitsue Kawashima (Department of Regenerative and Infectious Pathology, Hamamatsu University School of Medicine) for their excellent technical assistance. This work was supported by the Japan Society for the Promotion of Science, KAKENHI Grant Number 23590445.
Materials
| Tris; tris(hydroxymethyl)- aminomethane | Sigma-Aldrich | T-6791 | |
| HCl | Sigma-Aldrich | H-1758 | |
| pEGFP-N1 vector | Clontech | #6085-1 | |
| D-sorbitol | Sigma-Aldrich | S-1876 | |
| SPHERO TM Fluorescent Polystyrene Nile Red 0.04-0.06 | Spherotech, Inc. | FP-00556-2 | |
| SPHERO TM Fluorescent Polystyrene Nile Red 0.1-0.3 | Spherotech, Inc. | FP-0256-2 | |
| SPHERO TM Fluorescent Polystyrene Nile Red 1.7-2.2 | Spherotech, inc. | FP-2056-2 | |
| 10% mouse serum | DAKO | X0910 | |
| C57BL/6 mouse | SLC, Inc. | ||
| ICR mouse | SLC, Inc. | ||
| Modified Microliter Syringes (7000 Series) | Hamilton company | ||
| 35-gauge needle | Saito Medical | ||
| A Wee Sight Transilluminator | Phillips Healthcare | 1017920 | |
| O.C.T.Compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| RNase A | Sigma-Aldrich | R4642 | |
| Nonidet(R) P-40 | Nacalai | 25223-04 | |
| citrate buffer (pH6) x10 | Sigma-Aldrich | C9999-100ml | |
| pepsin | Sigma-Aldrich | P6887 | |
| EDTA | dojindo | N001 | |
| Formamide | TCI | F0045 | |
| Dextran sulfate sodium salt | Sigma-Aldrich | 42867-5G | |
| Denhardt's Solution (50X) | ThermoFishcer sceintific | 750018 | |
| Yeast tRNA (10 mg/mL) | ThermoFishcer sceintific | AM7119 | |
| SSC x20 | Sigma-Aldrich | S6639 | |
| DAPI | ThermoFishcer sceintific | D1306 | |
| n-Hexane | Sigma-Aldrich | 296090 | |
| superfrost plus glass | ThermoFishcer sceintific | 12-55-18 | |
| Cytokeep II | Nippon Shoji Co. | ||
| FITC-conjugated Griffonia simplicifolia isolectin B4 | Vector laboratories, Inc. | L1104 | |
| Anti-Mouse CD31 (PECAM-1) PE | ebioscience | 12-0311 | |
| ProLong Gold | ThermoFishcer sceintific | P36934 | |
| BIOREVO | KEYENCE | BZ-9000E | |
References
- Philippe, N., et al. Pandoraviruses: amoeba viruses with genomes up to 2.5 Mb reaching that of parasitic eukaryotes. Science. 341 (6143), 281-286 (2013).
- Passini, M. A., et al. Intraventricular brain injection of adeno-associated virus type 1 (AAV1) in neonatal mice results in complementary patterns of neuronal transduction to AAV2 and total long-term correction of storage lesions in the brains of beta-glucuronidase-deficient mice. J Virol. 77 (12), 7034-7040 (2003).
- Kim, J. Y., et al. Viral transduction of the neonatal brain delivers controllable genetic mosaicism for visualising and manipulating neuronal circuits in vivo. Eur J Neurosci. 37 (8), 1203-1220 (2013).
- McLean, J. R., et al. Widespread neuron-specific transgene expression in brain and spinal cord following synapsin promoter-driven AAV9 neonatal intracerebroventricular injection. Neurosci Lett. 576, 73-78 (2014).
- Hsu, K. M., Pratt, J. R., Akers, W. J., Achilefu, S. I., Yokoyama, W. M. Murine cytomegalovirus displays selective infection of cells within hours after systemic administration. J Gen Virol. 90. 90 (Pt 1), 33-43 (2009).
- Sakao-Suzuki, M., et al. Aberrant fetal macrophage/microglial reactions to cytomegalovirus infection. Annals of Clinical and Translational Neruology. 1 (8), 570-588 (2014).
- Gombash Lampe, S. E., Kaspar, B. K., Foust, K. D. Intravenous injections in neonatal mice. J Vis Exp. (93), e52037 (2014).
- Kawasaki, H., et al. Cytomegalovirus initiates infection selectively from high-level beta1 integrin-expressing cells in the brain. Am J Pathol. 185 (5), 1304-1323 (2015).
- Rahim, A. A., et al. Intravenous administration of AAV2/9 to the fetal and neonatal mouse leads to differential targeting of CNS cell types and extensive transduction of the nervous system. FASEB J. 25 (10), 3505-3518 (2011).
- Cannon, M. J., Davis, K. F. Washing our hands of the congenital cytomegalovirus disease epidemic. Bmc Public Health. 5, (2005).
- Frenkel, L. D., Keys, M. P., Hefferen, S. J., Rola-Pleszczynski, M., Bellanti, J. A. Unusual eye abnormalities associated with congenital cytomegalovirus infection. Pediatrics. 66 (5), 763-766 (1980).
- Becroft, D. M. Prenatal cytomegalovirus infection: epidemiology, pathology and pathogenesis. Perspect Pediatr Pathol. 6, 203-241 (1981).
- Conboy, T. J., et al. Intellectual development in school-aged children with asymptomatic congenital cytomegalovirus infection. Pediatrics. 77 (6), 801-806 (1986).
- Fowler, K. B., et al. The outcome of congenital cytomegalovirus infection in relation to maternal antibody status. N Engl J Med. 326 (10), 663-667 (1992).
- Cannon, M. J. Congenital cytomegalovirus (CMV) epidemiology and awareness. J Clin Virol. 46 Suppl 4, S6-S10 (2009).
- Grassi, M. P., et al. Microglial nodular encephalitis and ventriculoencephalitis due to cytomegalovirus infection in patients with AIDS: two distinct clinical patterns. Clin Infect Dis. 27 (3), 504-508 (1998).
- Kawasaki, H., Mocarski, E. S., Kosugi, I., Tsutsui, Y. Cyclosporine inhibits mouse cytomegalovirus infection via a cyclophilin-dependent pathway specifically in neural stem/progenitor cells. J Virol. 81 (17), 9013-9023 (2007).
- Britt, W. J. Human cytomegalovirus: propagation, quantification, and storage. Curr Protoc Microbiol. Chapter 14, Unit 14E 13 (2010).
- Kawasaki, H., Kosugi, I., Arai, Y., Iwashita, T., Tsutsui, Y. Mouse embryonic stem cells inhibit murine cytomegalovirus infection through a multi-step process. PLoS One. 6 (3), e17492 (2011).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. (65), (2012).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Cutting sections of paraffin-embedded tissues. CSH Protoc. , (2008).
- Chi, V., Chandy, K. G. Immunohistochemistry: paraffin sections using the Vectastain ABC kit from vector labs. J Vis Exp. (8), e308 (2007).
- Wilsbacher, L. D., Coughlin, S. R. Analysis of cardiomyocyte development using immunofluorescence in embryonic mouse heart. J Vis Exp. (97), (2015).
- Ohshima, M., et al. Intraperitoneal and intravenous deliveries are not comparable in terms of drug efficacy and cell distribution in neonatal mice with hypoxia-ischemia. Brain Dev. 37 (4), 376-386 (2015).
- Kim, J. Y., Grunke, S. D., Levites, Y., Golde, T. E., Jankowsky, J. L. Intracerebroventricular viral injection of the neonatal mouse brain for persistent and widespread neuronal transduction. J Vis Exp. (91), e51863 (2014).
- Glascock, J. J., et al. Delivery of therapeutic agents through intracerebroventricular (ICV) and intravenous (IV) injection in mice. J Vis Exp. (56), (2011).
