Intracerebroventrikulær og intravaskulær injeksjon av viruspartikler og Fluorescent mikroperler inn i Neonatal Brain

Summary

Here, we describe a simple method of intracerebroventricular and intravascular injection of viral particles or fluorescent microbeads into the neonatal mouse brain. The localization pattern of the virus and nanoparticles could be detected by microscopic evaluation or by in situ hybridization.

Abstract

I studien på patogenesen av viral encefalitt, er infeksjonen metode kritisk. Den første av de to hovedinfeksjonsveier til hjernen er det hematogenous rute som involverer infeksjon av endotelcellene og pericytes i hjernen. Den andre er intracerebroventrikulær (ICV) rute. Når innenfor det sentrale nervesystemet (CNS), kan virus spre seg til subarachnoid plass, hjernehinnene, og choroid plexus via spinalvæsken. I eksperimentelle modeller, er de tidligste stadiene av CNS viral distribusjon ikke godt karakterisert, og det er uklart om bare visse celler blir først smittet. Her har vi analysert fordelingen av cytomegalovirus (CMV) partikler under den akutte fase av infeksjonen, betegnet primær viremi etter ICV eller intravaskulær (IV) injeksjon i den neonatale mus hjernen. I ICV injeksjons modellen, ble 5 ul murine CMV (mCMV) eller fluorescerende mikrokuler injiseres inn i den laterale ventrikkel i midpoint mellom øret og øyet ved anvendelse av en 10-mL sprøyte med en 27 G nål. I IV-injeksjon modellen, ble en 1 ml sprøyte med en 35 G nål anvendes. En transilluminator ble brukt til å visualisere den overfladiske temporal (ansikts) åre av den neonatale mus. Vi tilført 50 ul mCMV eller fluorescerende mikroperler inn i overfladiske temp blodåre. Hjerner ble innhøstet ved forskjellige tidspunkter etter injeksjon. MCMV genomer ble påvist ved hjelp av in situ hybridisering metode. Fluorescent mikroperler eller grønt fluorescerende protein uttrykker rekombinante mCMV partiklene ble observert av fluorescerende mikroskopi. Disse teknikkene kan brukes på mange andre patogener for å undersøke patogenesen av encefalitt.

Introduction

Når man studerer viral encefalitt, er den initiale fordeling av virale partikler meget viktig å forstå sykdom patogenese, og å identifisere virale mål i hjernen. De fleste virus varierer i størrelse fra 20 til 300 nm, selv om Pandoravirus er mer enn 700 nm i størrelse ^1. Fordelingen av de virale partikler i den akutte fase av infeksjonen kan være avhengig av størrelsen av partiklene, fordelingen av cellulære reseptorer, eller affiniteten av de cellulære reseptorer for virus. I dyremodeller intracerebroventrikulær (ICV), intraperitoneal, direkte placenta, og intravenøs (IV) infeksjoner har blitt brukt til å studere patogenesen av viral encefalitt. ICV inokulering med virus blir ofte brukt til å etablere sentralnervesystemet (CNS) infeksjoner i mus. Studier ved hjelp av denne teknikken rapportere utbredte infeksjoner, særlig av celler i periventrikulær soner og i områder av hjernen i direkte kontakt med cerebrospinalvæske (CSF), Similär til effekten av viral ventriculoencephalitis. Den lille størrelsen på adeno-assosiert virus (AAV) partikler (20 – 25 nm i diameter) letter deres spredning i hele hjernen i ICV infeksjoner ^2-4. Intraperitoneal ^5, direkte placenta ^6, og IV injeksjoner ⁷ representerer hematogenic systemisk administrasjon. Inntrengning av viruspartikler gjennom blod-hjerne-barrieren (BBB) ​​gjør det mulig for dem å nå parenchyma av den neonatale hjerne, som representerer diffuse mikrogliaceller knuter ^8,9.

Cytomegalovirus (CMV) er et vanlig virus som tilhører herpesvirusfamilien. I USA, 50% – har 80% av befolkningen hadde CMV infeksjon etter alder 40. CMV infeksjoner er sjelden skadelig, men kan forårsake sykdom hos immunsupprimerte pasienter og fostre. Av alle leveranser, 0,2% – er 2% født med CMV ^10, noe som resulterer i alvorlige symptomer som microcephaly, periventrikulær forkalkning, lillehjernen Hypoplasia, micrøyebetennelse, og synsnerven atrofi ^11,12. Videre forekomme mental retardasjon, sensorinevralt hørselstap, synsfeil, beslag og epilepsi i ca 10% av ikke-uopprettelige CMV-infiserte spedbarn ^13,14. CNS dysfunksjon er den mest vanlige karakteristiske symptomet på CMV medfødt avvik. Flere barn er permanent deaktivert hvert år av medfødt CMV enn ved Down syndrom, føtalt alkoholsyndrom, eller ryggmargsbrokk ^15. Det finnes ingen vaksine mot CMV tilgjengelig på det nåværende, ringer for et behov for en trygg og effektiv vaksine. Å studere interaksjonen av CMV-partikler med deres reseptorer i den tidligste fase av infeksjonen er viktig å forstå virkningen av vaksinasjon.

Ventriculoencephalitis og diffuse mikrogliaceller knuter er de to viktigste patologiske kjennetegn ved CMV encefalitt ^16. Det har vært usikkert hvor CMV-partikler (150-300 nm) spredd gjennom hjernen i den akutte fase av infeksjonen ennd hvordan fordelingen av cellulære reseptorer og deres affinitet for virus bidra til viral spredning. Kawasaki et al. Har evaluert ICV og IV infeksjoner fra perspektivet av fordelingen av partiklene og deres reseptorer (β1 integrin) i den tidligste fase av infeksjonen. Vi har funnet at spredning av CMV-partikler og ekspresjonen av integrin β1 er godt korrelert i den tidligste fase av infeksjonen i både ICV og IV infeksjoner ^8. ICV infeksjon er en modell av ventriculoencephalitis og IV infeksjon er en modell av diffuse mikrogliaceller knuter. Studerer dynamikken i virale eller fluorescerende partikler vil gi nyttig informasjon om effekten av partikkelstørrelse, viral interaksjon med cellulære reseptorer, og mekanismen for BBB penetrasjon i hjernen. Den følgende protokoll kan benyttes for å undersøke eventuelle virusinfeksjoner og virusvektor i CNS.

Protocol

Alle forsøksprotokoller ble godkjent av Animal Care komité Hamamatsu University of School of Medicine. 1. Utarbeidelse av mCMV (Smith stamme) og rekombinant M32-forbedret grønt fluorescerende protein (EGFP) -MCMV Generer rekombinant M32-EGFP-mCMV henhold til fremgangsmåten som følger (1.2 til 1.9), og som tidligere beskrevet 8. Bruke rekombinante virus utledet fra Smith-stamme av villtype mCMV (deponeringsnummer: U68299). Sett EGFP (4,361 basepar, bp) mel…

Representative Results

I studier av patogenesen av viral encefalitt, er smittemåte viktig. Den hematogenous rute utgjør en akutt infeksjon av endotelcellene og pericytes av hjernen, mens den ICV rute utgjør en akutt infeksjon sprer seg via CSF gjennom subarachnoid plass, rekker til hjernehinnene og choroid plexus. For å analysere den første fordelingen av partiklene i akutte hjernebetennelse, in situ hybridisering detektere mCMV genomer og direkte observasjon av M32-EGFP-mCMV partikler eller fluo…

Discussion

I dyremodeller, ICV, intraperitoneal, direkte placenta og IV-infeksjoner har blitt brukt til å studere patogenesen av viral encefalitt. Vi fokuserte på ICV og IV injeksjon modeller av neonatal mus for enkelhet av prosedyrene og fordelen av direkte injeksjon av partikler i målområdet. Selv intraperitoneal infeksjon er en enkel metode, viruspartikler spres systemisk via en indirekte prosess ^5,24. Direkte placenta infeksjon er en god metode for å studere embryonale systemisk infeksjon. Men denne metoden kre…

Materials

Tris; tris(hydroxymethyl)- aminomethane	Sigma-Aldrich	T-6791
HCl	Sigma-Aldrich	H-1758
pEGFP-N1 vector	Clontech	#6085-1
D-sorbitol	Sigma-Aldrich	S-1876
SPHERO TM Fluorescent Polystyrene Nile Red 0.04-0.06	Spherotech, Inc.	FP-00556-2
SPHERO TM Fluorescent Polystyrene Nile Red 0.1-0.3	Spherotech, Inc.	FP-0256-2
SPHERO TM Fluorescent Polystyrene Nile Red 1.7-2.2	Spherotech, inc.	FP-2056-2
10% mouse serum	DAKO	X0910
C57BL/6 mouse	SLC, Inc.
ICR mouse	SLC, Inc.
Modified Microliter Syringes (7000 Series)	Hamilton company
35-gauge needle	Saito Medical
A Wee Sight Transilluminator	Phillips Healthcare	1017920
O.C.T.Compound	Sakura Finetek	4583
RNase A	Sigma-Aldrich	R4642
Nonidet(R) P-40	Nacalai	25223-04
citrate buffer (pH6) x10	Sigma-Aldrich	C9999-100ml
pepsin	Sigma-Aldrich	P6887
EDTA	dojindo	N001
Formamide	TCI	F0045
Dextran sulfate sodium salt	Sigma-Aldrich	42867-5G
Denhardt's Solution (50X)	ThermoFishcer sceintific	750018
Yeast tRNA (10 mg/mL)	ThermoFishcer sceintific	AM7119
SSC x20	Sigma-Aldrich	S6639
DAPI	ThermoFishcer sceintific	D1306
n-Hexane	Sigma-Aldrich	296090
superfrost plus glass	ThermoFishcer sceintific	12-55-18
Cytokeep II	Nippon Shoji Co.
FITC-conjugated Griffonia simplicifolia isolectin B4	Vector laboratories, Inc.	L1104
Anti-Mouse CD31 (PECAM-1) PE	ebioscience	12-0311
ProLong  Gold	ThermoFishcer sceintific	P36934
BIOREVO	KEYENCE	BZ-9000E