أزاله الحساسية والتعافي من المستقبلات الضوئية جراد الصيد عند تسليم التحفيز الخفيفة
Summary
يتم تقديم بروتوكول لدراسة التحسس والحساسية استعاده المستقبلات فوتوفيش كوظيفة من وقت الساعة البيولوجية.
Abstract
يتم تقديم طريقه لدراسة الحساسية واستعاده المستقبلات الضوئية جراد الصيد. قمنا بأداء التسجيلات الكهربائية داخل الخلايا للخلايا المستقبلة الضوئية في اييستالكس المعزولة باستخدام تكوين الجهد الكهربي المتحول الأحادي المتقطع. أولا ، مع شفره حلاقه قمنا بفتح في القرنية الظهرية للوصول إلى شبكيه العين. بعد ذلك ، قمنا بإدخال القطب الزجاجي من خلال الفتحة ، واخترقت خليه كما ذكرت من قبل تسجيل المحتملة السلبية. وقد فرضت إمكانات الغشاء في إمكانات الراحة للمستقبلات الضوئية وتم تطبيق نبض ضوئي لتنشيط التيارات. وأخيرا ، استخدم بروتوكول الوميض الضوئي لقياس التحسس والانتعاش الحاليين. الاولي [ليغت-فلش] مشغلات, بعد فتره متاخره, ال [ترنسكايشن] تيار أيونيه, اي بعد يبلغ ذروه اتساع [دبل] نحو دوله [ديستيزد]; الفلاش الثاني ، الذي يطبق علي فترات زمنيه مختلفه ، يقيم حاله التوصيل المنشط الخفيف. لتوصيف التيار الذي اثار الضوء ، تم قياس ثلاثه معلمات: 1) الكمون (الوقت المنقضي بين التسليم فلاش ضوء واللحظة التي يحقق الحالي 10 ٪ من قيمته القصوى) ؛ 2) الذروة الحالية ؛ و 3) الحساسية الوقت الثابت (ثابت الوقت الاسي للمرحلة الاضمحلال الحالي). تتاثر جميع المعلمات بالنبضة الاولي.
ولتحديد كميه الاسترداد من التحسس ، استخدمت النسبة p2/p1 مقابل الوقت بين البقول. p1 هو ذروه الحالية التي أثيرت من قبل النبض الضوئي الأول ، و p2 هو ذروه الحالية التي اثارها النبض الثاني. وقد تم تركيب هذه البيانات علي مجموع الوظائف الاسيه. وأخيرا ، تم اجراء هذه القياسات كوظيفة من وقت الساعة البيولوجية.
Introduction
ولكي ينظر اليه علي انه محفز بصري ، يجب ان يكون الضوء الذي يصل إلى العينين محولا إلى اشاره كهربائيه. التالي ، في جميع الكائنات البصرية ، والضوء يؤدي محول التيار الأيوني ، والتي بدورها تنتج تغييرا في القدرة الغشائية للخلايا المستقبلات الضوئية ، ما يسمي مستقبلات المحتملة. وبسبب هذا ، فان حساسية الضوء في العين تعتمد أساسا علي حاله التوصيل المنشط الخفيف ، والذي يمكن ان يكون اما متاحا ليتم تنشيطه أو تحسسه.
في المستقبلات الضوئية لجراد الصيد ، يؤدي الضوء بطيئه ، عابره ، الايونيه الحالية1. عند الاضاءه ، ينشا تيار المحول بعد التاخر أو الكمون قبل الوصول إلى الحد الأقصى ؛ بعد ذلك [ديايز], بما ان ال [ترنسكايشن] قنوات يسقط داخل [ديستيزد] دوله في اي هم يكون لا يستجيبون إلى بعيده ضوء تحفيز2. وهذا هو ، الضوء ، بالاضافه إلى تفعيل الحالية محول المسؤولية من الرؤية ، ويدفع أيضا تناقص عابره من حساسية الخلايا مستقبلات ضوئيه. وقد تمثل أزاله الحساسية اليه حماية عامه ضد التعرض المفرط لحافز كاف. يتم استرداد حساسية العين للضوء كما يتعافى التوصيل المحول من التحسس.
التسجيل داخل الخلايا هو تقنيه مفيده لقياس النشاط الكهربائي للخلايا المنفعلة3،4،5،6،7،8. ومن أمثله هذه الاخيره الخلايا المنوية10 والخلايا المستقبلة الضوئية التي درست هنا. في تجربتنا ، مستنقعات المستقبلات الضوئية Procambarus من الصعب عزل والحفاظ علي الثقافة الابتدائية ؛ بالاضافه إلى ذلك ، فهي قضبان رقيقه تجعل من الصعب التوصل إلى تشكيل الختم جيجا. في التسجيلات داخل الخلايا ، يتم متقدمة قطب حاد في خليه التي يتم الاحتفاظ بها في مكان من قبل الانسجه المحيطة بها. يتم تقطيع القطب بواسطة الدوائر التبديل عاليه السرعة من مكبر للصوت ، لذلك يتم أخذ عينات الحالية بين نبضات الجهد. ويعرف هذا الوضع بأنه المشبك الجهد الكهربي أحادي القطب (وضع dSEVC)11. المقاومة العالية (الفتحة الصغيرة) للالكترود تعيق التبادل المتبادل بين الخلية ومحاليل الماصة ، مما يؤدي إلى الحد الأدنى من الاضطراب في الوسط داخل الخلايا3. والعيب المحتمل لهذه التقنية هو ان الادراج القطب قد تنتج تيار غير انتقائي تسرب; لذلك ، يجب توخي الحذر لتجنب التسجيل من الخلايا حيث حجم التسريب الحالي قد تتداخل مع القياسات المقصودة4،12.
هنا ، ونحن نستخدم اييستالكس معزولة جراد الصيد لتقييم الحساسية والانتعاش من التشغيل الضوئي أيون التنشيط عن طريق أداء التسجيلات الكهربائية داخل الخلايا للخلايا مستقبلات الضوئية تحت ظروف مشبك الجهد.
Protocol
Representative Results
Discussion
وقد ثبت ان جراد الصيد نموذجا ممتازا بسبب قدرته علي البقاء علي قيد الحياة في ظل ظروف غير طبيعيه. هناك سهوله الوصول إلى في الجسم المجري وفي المختبر التحليلات الفسيولوجية الكهربائية. الاضافه إلى ذلك ، فان القشريات هي مجموعه مواتيه للبحوث البيولوجية العصبية في مجال المقارنة الزمنيه…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وكان هذا العمل مدعوما بمنحه من الUNAM IN224616-RN224616. ويود أصحاب البلاغ ان يشكروا السيدة جوزيفينا بولادو ، رئيسه أداره الترجمة الورقية العلمية ، من شعبه البحوث في كليه الطب ، UNAM ، علي تحرير النسخة الانكليزيه من هذه المخطوطة.
Materials
| Axoclamp2A | Axon Instruments Inc | Amplifier | |
| Digidata 1200 Interface | Axon Instruments Inc | Digitizer | |
| Oscilloscope TDS430A | Tektronix | Analogic Oscilloscope | |
| Photostimulator PS33 Plus | Grass | Lamp | |
| Puller PC-100 | Narishige | Micropipette Puller | |
| Puller P-97 | Sutter Instruments | Micropipette Puller | |
| Glass Capillary Tube Kimax-51 | Kimble Products | 34502 | 0.8, 1.10, 100 mm |
| HS-2 Headstage | Axon Instruments Inc | Headstage | |
| Micromanipulator MX-4 | Narishige | Mechanical Micromanipulator | |
| Stereoscopic Microscope | Zeiss | Microscope | |
| pClamp | Axon Instruments Inc | Data acquisition software for digidata 1200 interface | |
| Clampfit | Axon Instruments Inc | Analysis software linked to pClamp | |
| Origin | OriginLab Corp. | Data analysis and graphing software | |
| Sodium Chloride | Sigma | S7653 | >99.5% |
| Potassium Chloride | Sigma | P-9333 | Minimum 99% |
| Magnesium Sulfate | Sigma | M7506 | Minimum 99.5% |
| Calcium Chloride | Sigma | C5080 | Minimum 99.0% |
| Hepes | Sigma | H7523 | >99.5% |
| Sodium Hydroxide | Sigma | S8045 | 98.00% |
| Sodium hypochlorite solution | Sigma | 425044 | Available chlorine, 10-15% |
References
- Barriga-Montoya, C., Gómez-Lagunas, F., Fuentes-Pardo, B. Effect of pigment dispersing hormone on the electrical activity of crayfish visual photoreceptors during the 24-h cycle. Comp. Biochem. Physiol. A Comp. Physiol. 157 (4), 338-345 (2010).
- Barriga-Montoya, C., de la O-Martínez, A., Fuentes-Pardo, B., Gómez-Lagunas, F. Desensitization and recovery of crayfish photoreceptors. Dependency on circadian time, and pigment-dispersing hormone. Comp. Biochem. Physiol. A Comp. Physiol. 203, 297-303 (2017).
- Wickenden, A. D. Overview of electrophysiological techniques. Curr. protoc. pharmacol. 11, 1-17 (2014).
- Brette, R., Destexhe, A. Intracellular recording. Handbook of Neural Activity Measurement. , 44-91 (2012).
- Cummins, D., Goldsmith, T. H. Cellular identification of the violet receptor in the crayfish eye. J. Comp. Physiol. 142 (2), 199-202 (1981).
- Eguchi, E. Rhabdom structure and receptor potentials in single crayfish retinular cells. J. Cell and Comp. Physiol. 66, 411-430 (1965).
- Nosaki, H. Electrophysiological study of color encoding in the compound eye of crayfish, Procambarus clarkii. Z. vergl. Physiologie. 64 (3), 318-323 (1969).
- Miller, C. S., Glantz, R. M. Visual adaptation modulates a potassium conductance in retinular cells of the crayfish. Vis Neurosci. 17 (3), 353-368 (2000).
- Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflugers Arch. 391 (2), 85-100 (1981).
- Lishko, P., Clapham, D. E., Navarro, B., Kirichok, Y. Sperm patch-clamp. Methods Enzymol. 525, 59-79 (2013).
- Finkel, A. Axoclamp-2A microelectrode clamp theory and operation. Axon Instruments, Inc. , (1990).
- Sakmann, B. . Single-channel recording. , (2013).
- Van Harreveld, A. A physiological solution for freshwater crustacea. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 34 (4), 428-432 (1936).
- Oesterle, A. . pipette cookbook. , 97 (2008).
- Fuentes-Pardo, B., Ramos-Carvajal, J. The phase response curve of electroretinographic circadian rhythm of crayfish. Comp. Biochem. Physiol. A Comp. Physiol. 74 (3), 711-714 (1983).
- Pace-Schott, E. F., Hobson, J. A. The neurobiology of sleep: genetics, cellular physiology and subcortical networks. Nat. Rev. Neurosci. 3 (8), 591-605 (2002).
- Pittendrigh, C. S., Aschoff, J. On the mechanism of the entrainment of a circadian rhythm by light cycles. Circadian Clocks. , 277-297 (1965).
- Pittendrigh, C. S., Aschoff, J. Circadian systems: entrainment. Handbook Behavioral Neurobiology Biological Rhythms. , 94-124 (1981).
- Vitaterna, M. H., Takahashi, J. S., Turek, F. W. Overview of circadian rhythms. Alcohol Res. Health. 25 (2), 85-93 (2001).
- Hille, B. . Ion channels of excitable membranes. 507, (2001).
- Dircksen, H., Strauss, J. Circadian clocks in crustaceans: identified neuronal and cellular systems. Front Biosci. 15, 1040-1074 (2010).
- Terakita, A., Hariyama, T., Tsukahara, Y., Katsukura, Y., Tashiro, H. Interaction of GTP-binding protein Gq with photoactivated rhodopsin in the photoreceptor membranes of crayfish. FEBS Lett. 330, 197-200 (1993).
- Terakita, A., Takahama, H., Hariyama, T., Suzuki, T., Tsukahara, Y. Light regulated localization of the beta-subunit of Gq-type G-protein in the crayfish photoreceptors. J Comp Physiol A. 183 (4), 411-417 (1998).
- Terakita, A., Takahama, H., Tamotsu, S., Suzuki, T., Hariyama, T., Tsukahara, Y. Light-modulated subcellular localization of the alpha-subunit of GTP-binding protein Gq in crayfish photoreceptors. Vis Neurosci. 13 (3), 539-547 (1996).
