Десенсибилизация и восстановление фоторецепторов раков после доставки легкого стимула
Summary
Представлен протокол для изучения десенсибилизации и восстановления чувствительности фоторецепторов раков в качестве функции циркадного времени.
Abstract
Представлен метод изучения десенсибилизации и восстановления фоторецепторов раков. Мы провели внутриклеточные электрические записи фоторецепторных клеток в изолированных глазах с использованием прерывистой конфигурации с одноэлектрическим переключенным напряжением-зажимом. Во-первых, с лезвием бритвы мы сделали отверстие в донской роговицы, чтобы получить доступ к сетчатке. После этого мы вставили стеклянный электрод через отверстие, и проникли в клетку, как сообщается в записи отрицательного потенциала. Мембранный потенциал был зажат на потенциале отдыха фоторецептора и свет-пульс был применен для активации токов. Наконец, для измерения текущей десенсибилизации и восстановления использовался два протокола о вспышках света. Первая световая вспышка запускает после периода задержки трансдукционный ионный ток, который после достижения пика амплитуды распадается к десенсибилизированному состоянию; вторая вспышка, применяемая с разной временной интервалами, оценивает состояние свето-активированной проводимости. Для характеристики светосвязанного тока были измерены три параметра: 1) задержка (время, прошедшее между доставкой вспышки света и моментом, когда ток достигает 10% от его максимального значения); 2) пикового тока; и 3) константа времени десенсибилизации (экспоненциальная константа времени текущей фазы распада). На все параметры влияет первый импульс.
Для количественной оценки восстановления после десенсибилизации использовалось соотношение p2/p1 по сравнению со временем между импульсами. p1 — это пиковое ток, вызываемый первым световым импульсом, а p2 — пиковым током, вызванным вторым импульсом. Эти данные были приспособлены к сумме экспоненциальных функций. Наконец, эти измерения были проведены в качестве функции циркадного времени.
Introduction
Для того, чтобы восприниматься как визуальный стимул, свет, достигающий глаз, должен быть преобразован в электрический сигнал. Следовательно, во всех зрительных организмах свет вызывает трансдукционный ионный ток, который, в свою очередь, производит изменение мембранного потенциала фоторецепторных клеток, так называемого рецепторного потенциала. Из-за этого светочувствительность глаза в первую очередь зависит от состояния светоактивированной проводимости, которая может быть либо доступна для активации, либо десенсибилизирована.
В фоторецепторах раков свет вызывает медленный, переходный, ионный ток1. При освещении трансдукционный ток возникает после задержки или задержки до достижения своего максимума; после этого он распадается, так как каналы трансдукции попадают в десенсибилизированное состояние, в котором они не реагируют на дальнейший свет стимул2. То есть, свет, в дополнение к активации трансдукционного тока, отвечающего за зрение, также вызывает переходное декременцию чувствительности фоторецепторных клеток. Десенсибилизация может представлять собой общий защитный механизм против чрезмерного воздействия адекватного стимула. Чувствительность глаза к свету восстанавливается по мере восстановления трансдукции после десенсибилизации.
Внутриклеточная запись является полезным методом измерения электрической активности возбудимых клеток3,4,5,6,7. Хотя внутриклеточная запись стала менее частой с появлением патч-зажима техники9,это все еще удобный подход, когда клетки либо трудно изолировать, или представить геометрию, что делает формирование патч-зажимных гига-уплотнений трудно(т.е.,уплотнения или плотные контакты между патч электрод и мембраны с электрическим сопротивлением порядка 10ohms). Примерами последних являются сперматозоиды10 и изученные фоторецепторные клетки. По нашему опыту, фоторецепторы Procambarus clarkii трудно изолировать и сохранить в первичной культуре; кроме того, они являются тонкими стержнями, которые делают гига-печать формирования трудно достичь. Во внутриклеточных записях острый электрод превращается в клетку, которая удерживается на месте окружающими тканями. Электрод рубится высокоскоростной схемой переключения усилителя, поэтому ток пробирается между импульсами напряжения. Этот режим известен как прерывистый зажим одноэлектронного напряжения (режим dSEVC)11. Высокое сопротивление (небольшое отверстие) электрода препятствует диффузионному обмену между клеткой и растворами пипетки, что дает минимальное нарушение внутриклеточной среды3. Потенциальным недостатком этого метода является то, что вставка электрода может привести к неселективному току утечки; поэтому необходимо проявлять осторожность, чтобы избежать записи из клеток, где размер тока утечки может помешать предполагаемым измерениям4,12.
В этом случае мы используем изолированные глаза раков для оценки десенсибилизации и восстановления светоактивной ионной проводимости путем выполнения внутриклеточных электрических записей фоторецепторных клеток в условиях зажима напряжения.
Protocol
Representative Results
Discussion
Раки оказались отличной моделью из-за своей способности выживать в неестественных условиях. Существует легкий доступ к in vivo и in vitro электрофизиологических анализов. Кроме того, ракообразные являются благоприятной группой для нейробиологических исследований в области сравни…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана грантом DGAPA-UNAM IN224616-RN2224616. Авторы хотят поблагодарить г-жу Хосефина Боладо, руководителя Отдела научного перевода документов, от Диверсион де Инвестигацион в Факультете Медицины, НАУ, за редактирование англоязычной версии этой рукописи.
Materials
| Axoclamp2A | Axon Instruments Inc | Amplifier | |
| Digidata 1200 Interface | Axon Instruments Inc | Digitizer | |
| Oscilloscope TDS430A | Tektronix | Analogic Oscilloscope | |
| Photostimulator PS33 Plus | Grass | Lamp | |
| Puller PC-100 | Narishige | Micropipette Puller | |
| Puller P-97 | Sutter Instruments | Micropipette Puller | |
| Glass Capillary Tube Kimax-51 | Kimble Products | 34502 | 0.8, 1.10, 100 mm |
| HS-2 Headstage | Axon Instruments Inc | Headstage | |
| Micromanipulator MX-4 | Narishige | Mechanical Micromanipulator | |
| Stereoscopic Microscope | Zeiss | Microscope | |
| pClamp | Axon Instruments Inc | Data acquisition software for digidata 1200 interface | |
| Clampfit | Axon Instruments Inc | Analysis software linked to pClamp | |
| Origin | OriginLab Corp. | Data analysis and graphing software | |
| Sodium Chloride | Sigma | S7653 | >99.5% |
| Potassium Chloride | Sigma | P-9333 | Minimum 99% |
| Magnesium Sulfate | Sigma | M7506 | Minimum 99.5% |
| Calcium Chloride | Sigma | C5080 | Minimum 99.0% |
| Hepes | Sigma | H7523 | >99.5% |
| Sodium Hydroxide | Sigma | S8045 | 98.00% |
| Sodium hypochlorite solution | Sigma | 425044 | Available chlorine, 10-15% |
References
- Barriga-Montoya, C., Gómez-Lagunas, F., Fuentes-Pardo, B. Effect of pigment dispersing hormone on the electrical activity of crayfish visual photoreceptors during the 24-h cycle. Comp. Biochem. Physiol. A Comp. Physiol. 157 (4), 338-345 (2010).
- Barriga-Montoya, C., de la O-Martínez, A., Fuentes-Pardo, B., Gómez-Lagunas, F. Desensitization and recovery of crayfish photoreceptors. Dependency on circadian time, and pigment-dispersing hormone. Comp. Biochem. Physiol. A Comp. Physiol. 203, 297-303 (2017).
- Wickenden, A. D. Overview of electrophysiological techniques. Curr. protoc. pharmacol. 11, 1-17 (2014).
- Brette, R., Destexhe, A. Intracellular recording. Handbook of Neural Activity Measurement. , 44-91 (2012).
- Cummins, D., Goldsmith, T. H. Cellular identification of the violet receptor in the crayfish eye. J. Comp. Physiol. 142 (2), 199-202 (1981).
- Eguchi, E. Rhabdom structure and receptor potentials in single crayfish retinular cells. J. Cell and Comp. Physiol. 66, 411-430 (1965).
- Nosaki, H. Electrophysiological study of color encoding in the compound eye of crayfish, Procambarus clarkii. Z. vergl. Physiologie. 64 (3), 318-323 (1969).
- Miller, C. S., Glantz, R. M. Visual adaptation modulates a potassium conductance in retinular cells of the crayfish. Vis Neurosci. 17 (3), 353-368 (2000).
- Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflugers Arch. 391 (2), 85-100 (1981).
- Lishko, P., Clapham, D. E., Navarro, B., Kirichok, Y. Sperm patch-clamp. Methods Enzymol. 525, 59-79 (2013).
- Finkel, A. Axoclamp-2A microelectrode clamp theory and operation. Axon Instruments, Inc. , (1990).
- Sakmann, B. . Single-channel recording. , (2013).
- Van Harreveld, A. A physiological solution for freshwater crustacea. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 34 (4), 428-432 (1936).
- Oesterle, A. . pipette cookbook. , 97 (2008).
- Fuentes-Pardo, B., Ramos-Carvajal, J. The phase response curve of electroretinographic circadian rhythm of crayfish. Comp. Biochem. Physiol. A Comp. Physiol. 74 (3), 711-714 (1983).
- Pace-Schott, E. F., Hobson, J. A. The neurobiology of sleep: genetics, cellular physiology and subcortical networks. Nat. Rev. Neurosci. 3 (8), 591-605 (2002).
- Pittendrigh, C. S., Aschoff, J. On the mechanism of the entrainment of a circadian rhythm by light cycles. Circadian Clocks. , 277-297 (1965).
- Pittendrigh, C. S., Aschoff, J. Circadian systems: entrainment. Handbook Behavioral Neurobiology Biological Rhythms. , 94-124 (1981).
- Vitaterna, M. H., Takahashi, J. S., Turek, F. W. Overview of circadian rhythms. Alcohol Res. Health. 25 (2), 85-93 (2001).
- Hille, B. . Ion channels of excitable membranes. 507, (2001).
- Dircksen, H., Strauss, J. Circadian clocks in crustaceans: identified neuronal and cellular systems. Front Biosci. 15, 1040-1074 (2010).
- Terakita, A., Hariyama, T., Tsukahara, Y., Katsukura, Y., Tashiro, H. Interaction of GTP-binding protein Gq with photoactivated rhodopsin in the photoreceptor membranes of crayfish. FEBS Lett. 330, 197-200 (1993).
- Terakita, A., Takahama, H., Hariyama, T., Suzuki, T., Tsukahara, Y. Light regulated localization of the beta-subunit of Gq-type G-protein in the crayfish photoreceptors. J Comp Physiol A. 183 (4), 411-417 (1998).
- Terakita, A., Takahama, H., Tamotsu, S., Suzuki, T., Hariyama, T., Tsukahara, Y. Light-modulated subcellular localization of the alpha-subunit of GTP-binding protein Gq in crayfish photoreceptors. Vis Neurosci. 13 (3), 539-547 (1996).
