Désensibilisation et récupération des photorécepteurs d'écrevisses à la livraison d'un stimulus léger
Summary
Un protocole pour l’étude de la désensibilisation et de la récupération de sensibilité des photorécepteurs d’écrevisses en fonction du temps circadien est présenté.
Abstract
Une méthode pour étudier la désensibilisation et la récupération des photorécepteurs d’écrevisses est présentée. Nous avons exécuté des enregistrements électriques intracellulaires des cellules de photorécepteur dans les yeux isolés utilisant la configuration de tension-clamp simple discontinuous d’électrode-switched. Tout d’abord, avec une lame de rasoir, nous avons fait une ouverture dans la cornée dorsale pour avoir accès à la rétine. Par la suite, nous avons inséré une électrode de verre à travers l’ouverture, et pénétré une cellule comme indiqué par l’enregistrement d’un potentiel négatif. Le potentiel de membrane a été serré au potentiel de repos du photorécepteur et une impulsion lumineuse a été appliquée pour activer des courants. Enfin, le protocole de deux flash s’est vu utilisé pour mesurer la désensibilisation et la récupération actuelles. Le premier flash lumineux déclenche, après une période de décalage, le courant ionique de transduction qui, après avoir atteint un pic d’amplitude, se désintègre vers un état désensibilisé; le deuxième flash, appliqué à intervalles de temps variables, évalue l’état de la conductance activée par la lumière. Pour caractériser le courant lumineux, trois paramètres ont été mesurés : 1) la latence (le temps écoulé entre la livraison du flash lumineux et le moment où le courant atteint 10 % de sa valeur maximale); 2) le courant de pointe; et 3) temps de désensibilisation constant (constante de temps exponentielle de la phase actuelle de décomposition). Tous les paramètres sont affectés par la première impulsion.
Pour quantifier le rétablissement de la désensibilisation, le rapport p2/p1 a été employé par rapport au temps entre les impulsions. p1 est le courant de pointe évoqué par la première impulsion lumineuse, et p2 est le courant de pointe évoqué par la deuxième impulsion. Ces données ont été adaptées à une somme de fonctions exponentielles. Enfin, ces mesures ont été effectuées en fonction du temps circadien.
Introduction
Pour être perçu comme un stimulus visuel, la lumière atteignant les yeux doit être transduie dans un signal électrique. Ainsi, dans tous les organismes visuels, la lumière déclenche un ion-courant de transduction, qui à son tour produit un changement dans le potentiel membranaire des cellules photoréceptrices, le potentiel dit de récepteur. Pour cette raison, la sensibilité de la lumière de l’œil dépend principalement de l’état de la conductance activée par la lumière, qui peut être disponible pour être activé ou désensibilisé.
Dans les photorécepteurs d’écrevisses, la lumière déclenche un courant lent, transitoire et ionique1. Lors de l’illumination, le courant de transduction surgit après un décalage ou une latence avant d’atteindre son maximum; par la suite, il se désintègre, comme les canaux de transduction tombent dans un état désensibilisé dans lequel ils ne répondent pas à d’autres stimulus léger2. C’est-à-dire que la lumière, en plus d’activer le courant de transduction responsable de la vision, induit également une décrement transitoire de la sensibilité des cellules photoréceptrices. La désensibilisation peut représenter un mécanisme de protection général contre la surexposition à un stimulus adéquat. La sensibilité de l’œil à la lumière est récupérée lorsque la conductance de la transduction se remet d’une désensibilisation.
L’enregistrement intracellulaire est une technique utile pour mesurer l’activité électrique des cellules excitables3,4,5,6,7,8. Bien que l’enregistrement intracellulaire soit devenu moins fréquent avec l’avènement de la technique de patch-clamp9, il est toujours une approche commode quand les cellules sont soit difficiles à isoler, ou présentent une géométrie qui rend la formation des giga-scellements patch-clamping difficile(c.-à-d., joints ou étroits-contacts entre l’électrode de correction et les membranes avec la résistance électrique de l’ordre de 109ohms). Des exemples de ces derniers sont les spermatozoïdes10 et les cellules photoréceptrices étudiées. D’après notre expérience, les photorécepteurs Procambarus clarkii sont difficiles à isoler et à conserver dans la culture primaire; en outre, ce sont des tiges minces qui rendent la formation giga-sceau difficile à atteindre. Dans les enregistrements intracellulaires, une électrode pointue est avancée dans une cellule qui est maintenue en place par le tissu environnant. L’électrode est coupée par les circuits de commutation à grande vitesse de l’amplificateur, de sorte que le courant est échantillonné entre les impulsions de tension. Ce mode est connu sous le nom de pince discontinu de tension à une électrode (mode dSEVC)11. La résistance élevée (petite ouverture) de l’électrode entrave l’échange de diffusion entre la cellule et les solutions de pipette, ce qui donne une perturbation minimale du milieu intracellulaire3. Un inconvénient potentiel de cette technique est que l’insertion d’électrode peut produire un courant de fuite non sélectif ; par conséquent, il faut prendre soin d’éviter l’enregistrement à partir de cellules où la taille du courant de fuite peut interférer avec les mesures prévues4,12.
Ici, nous utilisons des tiges isolées d’écrevisses pour évaluer la désensibilisation et la récupération de la conductance d’ion activée par la lumière en effectuant des enregistrements électriques intracellulaires des cellules photorécepteurs dans des conditions de pince de tension.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’écrevisse s’est avérée être un excellent modèle en raison de sa capacité à survivre dans des conditions non naturelles. Il est facile d’accéder aux analyses électrophysiologiques in vivo et in vitro. En outre, les crustacés sont un groupe favorable pour la recherche neurobiologique dans le domaine de la chronobiologie comparative21.
Dans cet article, l’étude de la désensibilisation et de la récupération du courant de transduction-activ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ces travaux ont été soutenus par la subvention DGAPA-UNAM IN224616-RN224616. Les auteurs remercient Mme Josefina Bolado, chef du département de traduction scientifique de papier, de Division de Investigacion à Facultad de Medicina, UNAM, pour avoir édité la version anglaise de ce manuscrit.
Materials
| Axoclamp2A | Axon Instruments Inc | Amplifier | |
| Digidata 1200 Interface | Axon Instruments Inc | Digitizer | |
| Oscilloscope TDS430A | Tektronix | Analogic Oscilloscope | |
| Photostimulator PS33 Plus | Grass | Lamp | |
| Puller PC-100 | Narishige | Micropipette Puller | |
| Puller P-97 | Sutter Instruments | Micropipette Puller | |
| Glass Capillary Tube Kimax-51 | Kimble Products | 34502 | 0.8, 1.10, 100 mm |
| HS-2 Headstage | Axon Instruments Inc | Headstage | |
| Micromanipulator MX-4 | Narishige | Mechanical Micromanipulator | |
| Stereoscopic Microscope | Zeiss | Microscope | |
| pClamp | Axon Instruments Inc | Data acquisition software for digidata 1200 interface | |
| Clampfit | Axon Instruments Inc | Analysis software linked to pClamp | |
| Origin | OriginLab Corp. | Data analysis and graphing software | |
| Sodium Chloride | Sigma | S7653 | >99.5% |
| Potassium Chloride | Sigma | P-9333 | Minimum 99% |
| Magnesium Sulfate | Sigma | M7506 | Minimum 99.5% |
| Calcium Chloride | Sigma | C5080 | Minimum 99.0% |
| Hepes | Sigma | H7523 | >99.5% |
| Sodium Hydroxide | Sigma | S8045 | 98.00% |
| Sodium hypochlorite solution | Sigma | 425044 | Available chlorine, 10-15% |
References
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