Dessensibilização e recuperação de fotorreceptores de lagostins após a entrega de um estímulo leve
Summary
Um protocolo para o estudo da dessensibilização e recuperação da sensibilidade de fotorreceptores de lagostins em função do tempo circadiano é apresentado.
Abstract
Um método para estudar a dessensibilização e recuperação de fotorreceptores de lagostins é apresentado. Realizamos gravações elétricas intracelulares de células fotorreceptoras em eyestalks isolados usando a configuração de tensão-clamp comutada por eletrodo. Primeiro, com uma lâmina de barbear fizemos uma abertura na córnea dorsal para ter acesso à retina. Depois disso, inserimos um eletrodo de vidro através da abertura, e penetramos uma célula conforme relatado pelo registro de um potencial negativo. O potencial da membrana foi apertado no potencial de descanso do fotorreceptor e um luz-pulso foi aplicado para ativar correntes. Finalmente, o protocolo de dois flashs leves foi empregado para medir a dessensibilização e recuperação atuais. O primeiro flash de luz desencadeia, após um período de atraso, a corrente iônica de transdução, que depois de atingir uma amplitude máxima decai em direção a um estado dessensibilizado; o segundo flash, aplicado em intervalos de tempo variados, avalia o estado da condutância ativada pela luz. Para caracterizar a corrente provocada pela luz, três parâmetros foram medidos: 1) latência (o tempo decorrido entre a entrega de flash de luz e o momento em que a corrente atinge 10% de seu valor máximo); 2) pico de corrente; e 3) tempo de dessensibilização constante (tempo exponencial constante da fase atual de decadência). Todos os parâmetros são afetados pelo primeiro pulso.
Para quantificar a recuperação da dessensibilização, a razão p2/p1 foi empregada versus o tempo entre os pulsos. p1 é a corrente de pico evocada pelo primeiro pulso de luz, e p2 é a corrente de pico evocada pelo segundo pulso. Esses dados foram ajustados a uma soma de funções exponenciais. Finalmente, essas medidas foram realizadas em função do tempo circadiano.
Introduction
A fim de ser percebido como um estímulo visual, a luz atingindo os olhos deve ser transduzida em um sinal elétrico. Assim, em todos os organismos visuais, a luz desencadeia uma corrente íon-transducção, que por sua vez produz uma mudança no potencial de membrana das células fotorreceptoras, o chamado potencial receptor. Devido a isso, a sensibilidade à luz do olho depende principalmente do estado da condutância ativada pela luz, que pode estar disponível para ser ativada ou insensível.
Em fotorreceptores de lagostins, a luz desencadeia uma corrente lenta, transitória e iônica1. Após a iluminação, a corrente de transdução surge após um atraso ou latência antes de atingir o seu máximo; depois disso, decai, como os canais de transdução cair em um estado insensível em que eles não respondem a mais estímulo luz2. Ou seja, a luz, além de ativar a corrente de transdução responsável pela visão, também induz um decrement transitório da sensibilidade das células fotorreceptoras. A dessensibilização pode representar um mecanismo de proteção geral contra a superexposição a um estímulo adequado. A sensibilidade do olho à luz é recuperada à medida que a condução da transdução se recupera da dessensibilização.
A gravação intracelular é uma técnica útil para medir a atividade elétrica das células excitáveis3,4,5,6,7,8. Embora a gravação intracelular tenha se tornado menos frequente com o advento da técnica de braçadeira9,ainda é uma abordagem conveniente quando as células são difíceis de isolar, ou apresentam uma geometria que dificulta a formação das focas giga de fixação de remendos(ou seja,focas ou contatos apertados entre o eletrodo de remendo e membranas com resistência elétrica da ordem de 109ohms). Exemplos desteúltimo são espermatozóides10 e as células fotorreceptoras aqui estudadas. Em nossa experiência, os fotorreceptores Procambarus clarkii são difíceis de isolar e manter na cultura primária; além disso, são hastes finas que tornam difícil a formação giga-seal. Em gravações intracelulares, um eletrodo afiado é avançado em uma célula que é mantida no lugar pelo tecido circundante. O eletrodo é picado pelos circuitos de comutação de alta velocidade do amplificador, de modo que a corrente é amostrada entre pulsos de tensão. Este modo é conhecido como clampedede descontínuo de eletrodo único (modo dSEVC)11. A alta resistência (pequena abertura) do eletrodo dificulta a troca difusão entre a célula e as soluções de pipetas, produzindo uma perturbação mínima do ambiente intracelular3. Uma desvantagem potencial desta técnica é que a inserção de eletrodos pode produzir uma corrente de vazamento não seletiva; portanto, deve ser tomado cuidado para evitar o registro de células onde o tamanho da corrente de vazamento pode interferir com as medições pretendidas4,12.
Aqui, usamos eyestalks lagostins isolados para avaliar a dessensibilização e recuperação da condução de íons ativados pela luz apartir da realização de gravações elétricas intracelulares de células fotorreceptoras condições de braçadeira de tensão.
Protocol
Representative Results
Discussion
O lagostim provou ser um excelente modelo devido à sua capacidade de sobreviver em condições não naturais. Há fácil acesso a análises eletrofisiológicas in vivo e in vitro. Além disso, os crustáceos são um grupo favorável à pesquisa neurobiológica no campo da cronobiologia comparativa21.
Neste artigo, o estudo da dessensibilização e recuperação da corrente de transdução ativada pela luz das células fotorreceptoras de lagostins é m…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pela subvenção DGAPA-UNAM IN224616-RN224616. Os autores querem agradecer à Sra. Josefina Bolado, Chefe do Departamento de Tradução de Artigos Científicos, da División de Investigación da Facultad de Medicina, UNAM, por editar a versão em inglês deste manuscrito.
Materials
| Axoclamp2A | Axon Instruments Inc | Amplifier | |
| Digidata 1200 Interface | Axon Instruments Inc | Digitizer | |
| Oscilloscope TDS430A | Tektronix | Analogic Oscilloscope | |
| Photostimulator PS33 Plus | Grass | Lamp | |
| Puller PC-100 | Narishige | Micropipette Puller | |
| Puller P-97 | Sutter Instruments | Micropipette Puller | |
| Glass Capillary Tube Kimax-51 | Kimble Products | 34502 | 0.8, 1.10, 100 mm |
| HS-2 Headstage | Axon Instruments Inc | Headstage | |
| Micromanipulator MX-4 | Narishige | Mechanical Micromanipulator | |
| Stereoscopic Microscope | Zeiss | Microscope | |
| pClamp | Axon Instruments Inc | Data acquisition software for digidata 1200 interface | |
| Clampfit | Axon Instruments Inc | Analysis software linked to pClamp | |
| Origin | OriginLab Corp. | Data analysis and graphing software | |
| Sodium Chloride | Sigma | S7653 | >99.5% |
| Potassium Chloride | Sigma | P-9333 | Minimum 99% |
| Magnesium Sulfate | Sigma | M7506 | Minimum 99.5% |
| Calcium Chloride | Sigma | C5080 | Minimum 99.0% |
| Hepes | Sigma | H7523 | >99.5% |
| Sodium Hydroxide | Sigma | S8045 | 98.00% |
| Sodium hypochlorite solution | Sigma | 425044 | Available chlorine, 10-15% |
References
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