הפחתת רגישות והתאוששות של סרטן הנהרות בעת העברת גירוי באור
Summary
פרוטוקול לחקר הפחתת הרגישות וההתאוששות הרגישות של מנועי סרטן הסרטנים כפונקציה של הזמן האחראי מוצג.
Abstract
שיטה לחקר הפחתת רגישות והתאוששות של מנועי סרטן הנהרות מוצגת. ביצעת הקלטות חשמל תאיים של תאים תא קולט אור בתוך העיניים מבודדים באמצעות אלקטרודה רציפה בודדת ממותגת מתח-מהדק התצורה. עם סכין גילוח הצלחנו לפתוח את הקרנית. כדי לקבל גישה לרשתית העין לאחר מכן, הוספת אלקטרודה זכוכית דרך הפתח, וחדרה לתא כפי שדווח על ידי הקלטה של פוטנציאל שלילי. פוטנציאל הממברנה היה מהודק בפוטנציאל המנוחה של photoreceptor והדופק האור הוחל על הפעלת זרמים. בסופו של דבר, שני פרוטוקול פלאש האור הועסק כדי למדוד את הפחתת הרגישות וההתאוששות הנוכחית. האור הראשון מפעיל הבזק, לאחר תקופת השהיה, הזרם היוני התמרה, אשר לאחר שהגיע משרעת שיא לקראת מדינה בעלת הרגישות למדינה; ההבזק השני, המוחל במרווחי זמן משתנים, מעריך את מצב הכיוון של מוליכות האור המופעלת. כדי לאפיין את הזרם, שלושה פרמטרים נמדדו: 1) השהיה (הזמן שחלף בין מסירת פלאש קלה לבין הרגע שבו הנוכחי משיגה 10% מהערך המירבי שלו); 2) השיא הנוכחי; ו 3) הפחתת הרגישות קבוע זמן (קבוע זמן מעריכי של השלב ריקבון הנוכחי). כל הפרמטרים מושפעים מהפעימה הראשונה.
כדי לכמת התאוששות מהפחתת הרגישות, היחס p2/p1 היה מועסק לעומת הזמן בין פולסים. p1 היא הפיסגה העדכנית מעורר על ידי פולס האור הראשון, ו p2 הוא השיא הנוכחי מעורר על ידי הדופק השני. נתונים אלה הותאמו לסכום של פונקציות מעריכי. לבסוף, המידות האלה בוצעו כפונקציה של זמן מעגלי.
Introduction
כדי להיתפס כגירוי ויזואלי, האור המגיע לעיניים חייב להיות מחולק לאות חשמלי. מכאן, בכל האורגניזמים החזותיים, אור מפעיל יון התמרה-זרם, אשר בתורו מייצרת שינוי בפוטנציאל הממברנה של התאים תא קולט אור, הפוטנציאל הנקרא הקולטן. בשל כך, הרגישות הקלה של העין תלויה בעיקר במצב של מוליכות האור המופעלת, שיכולה להיות זמינה להפעלה או לחוסר הרגישות.
ב מנועי סרטן הנהרות, אור מעורר איטי, ארעי, זרם יוני1. עם התאורה, הזרימה הנוכחית מתעוררת לאחר השהיה או השהיה לפני שהגיעה למקסימום; לאחר מכן הוא decays כמו ערוצי התמרה ליפול למצב מתחת לחוסר הרגישות שבו הם אינם מגיבים לגירוי אור נוסף2. כלומר, אור, בנוסף להפעלה האחראית הנוכחית של חזון, משרה גם הפחתה ארעית של הרגישות של תאים תא קולט אור. הפחתת רגישות עשויה לייצג מנגנון הגנה כללי מפני חשיפה יתר לגירוי מספיק. הרגישות של העין לאור הוא התאושש כאשר מוליכות התמרה משחזרת מתוך הפחתת רגישות.
הקלטה תאיים היא טכניקה שימושית למדידת פעילות חשמלית של תאים להתרגש3,4,5,6,7,8. למרות הקלטה תאיים הפכה להיות פחות תכופים עם הופעתו של התיקון מהדק טכניקה9, זה עדיין גישה נוחה כאשר התאים הם קשים לבידוד, או להציג הגיאומטריה שהופך את היווצרות של התיקון-החותמות giga-אטמים קשה (כלומר, חותמות או קשר הדוק בין האלקטרודה תיקון ממברנות עם עמידות החשמל של הסדר של 109ohms). דוגמאות לאלה הן תאי זרע10 ותאים תא קולט אור כאן למדו. הניסיון שלנו, מאוד קשה לבודד ולשמור בתרבות הראשית; בנוסף, הם מוטות דקים הופכים giga-חותם היווצרות קשה להשיג. בהקלטות תאיים, אלקטרודה חדה מתקדמת לתא שנשמר במקום על ידי הרקמה הסובבת. האלקטרודה קצוצה על-ידי המעגלים העוברים במהירות גבוהה של המגבר, ולכן הזרם מנדגם בין פולסים במתח. מצב זה ידוע כתפס מקוטע של מתח יחיד באלקטרודה (מצב dSEVC)11. ההתנגדות הגבוהה (פתיחה קטנה) של האלקטרודה מעכבת את החילוף התפוצא בין התא לפתרונות הפיפטה, ומניב הפרעה מינימלית של הסביבה התאיים3. חיסרון פוטנציאלי של טכניקה זו היא כי החדרת אלקטרודה עשויה לייצר זרם דליפה לא סלקטיבי; לכן, יש לנקוט טיפול כדי למנוע הקלטה מתאים בהם גודל זרם הדליפה עלול להפריע למידות המיועדות4,12.
בזאת, אנו משתמשים בגבעולי סרטנים מבודדים כדי להעריך את הפחתת הרגישות וההתאוששות של מוליכות האור המופעל על ידי ביצוע הקלטות חשמל תאיים של תאים תא קולט אור באמצעות מהדק מתח התנאים.
Protocol
Representative Results
Discussion
סרטני הנהרות הוכיחו כמודל מצוין בשל יכולתה לשרוד בתנאים שאינם טבעיים. יש גישה קלה בvivo ובניתוחים אלקטרולוגיים מחוץ לגופית . בנוסף, סרטנים הם קבוצה חיובית עבור מחקר נוירוביולוגי בתחום הכרונוביולוגיה21השוואתי.
במאמר זה, המחקר של הפחתת הרגישות וההתאוששו?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכת על ידי D, UNAM IN224616-RN224616 גרנט. המחברים רוצים להודות לגברת ג’וזפינה בולאדו, ראש המחלקה לתרגום ניירות מדעיים, מאליפות דה בדיקה בפסולטד דה מדיטינה, UNAM, לעריכת הגרסה האנגלית של כתב יד זה.
Materials
| Axoclamp2A | Axon Instruments Inc | Amplifier | |
| Digidata 1200 Interface | Axon Instruments Inc | Digitizer | |
| Oscilloscope TDS430A | Tektronix | Analogic Oscilloscope | |
| Photostimulator PS33 Plus | Grass | Lamp | |
| Puller PC-100 | Narishige | Micropipette Puller | |
| Puller P-97 | Sutter Instruments | Micropipette Puller | |
| Glass Capillary Tube Kimax-51 | Kimble Products | 34502 | 0.8, 1.10, 100 mm |
| HS-2 Headstage | Axon Instruments Inc | Headstage | |
| Micromanipulator MX-4 | Narishige | Mechanical Micromanipulator | |
| Stereoscopic Microscope | Zeiss | Microscope | |
| pClamp | Axon Instruments Inc | Data acquisition software for digidata 1200 interface | |
| Clampfit | Axon Instruments Inc | Analysis software linked to pClamp | |
| Origin | OriginLab Corp. | Data analysis and graphing software | |
| Sodium Chloride | Sigma | S7653 | >99.5% |
| Potassium Chloride | Sigma | P-9333 | Minimum 99% |
| Magnesium Sulfate | Sigma | M7506 | Minimum 99.5% |
| Calcium Chloride | Sigma | C5080 | Minimum 99.0% |
| Hepes | Sigma | H7523 | >99.5% |
| Sodium Hydroxide | Sigma | S8045 | 98.00% |
| Sodium hypochlorite solution | Sigma | 425044 | Available chlorine, 10-15% |
References
- Barriga-Montoya, C., Gómez-Lagunas, F., Fuentes-Pardo, B. Effect of pigment dispersing hormone on the electrical activity of crayfish visual photoreceptors during the 24-h cycle. Comp. Biochem. Physiol. A Comp. Physiol. 157 (4), 338-345 (2010).
- Barriga-Montoya, C., de la O-Martínez, A., Fuentes-Pardo, B., Gómez-Lagunas, F. Desensitization and recovery of crayfish photoreceptors. Dependency on circadian time, and pigment-dispersing hormone. Comp. Biochem. Physiol. A Comp. Physiol. 203, 297-303 (2017).
- Wickenden, A. D. Overview of electrophysiological techniques. Curr. protoc. pharmacol. 11, 1-17 (2014).
- Brette, R., Destexhe, A. Intracellular recording. Handbook of Neural Activity Measurement. , 44-91 (2012).
- Cummins, D., Goldsmith, T. H. Cellular identification of the violet receptor in the crayfish eye. J. Comp. Physiol. 142 (2), 199-202 (1981).
- Eguchi, E. Rhabdom structure and receptor potentials in single crayfish retinular cells. J. Cell and Comp. Physiol. 66, 411-430 (1965).
- Nosaki, H. Electrophysiological study of color encoding in the compound eye of crayfish, Procambarus clarkii. Z. vergl. Physiologie. 64 (3), 318-323 (1969).
- Miller, C. S., Glantz, R. M. Visual adaptation modulates a potassium conductance in retinular cells of the crayfish. Vis Neurosci. 17 (3), 353-368 (2000).
- Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflugers Arch. 391 (2), 85-100 (1981).
- Lishko, P., Clapham, D. E., Navarro, B., Kirichok, Y. Sperm patch-clamp. Methods Enzymol. 525, 59-79 (2013).
- Finkel, A. Axoclamp-2A microelectrode clamp theory and operation. Axon Instruments, Inc. , (1990).
- Sakmann, B. . Single-channel recording. , (2013).
- Van Harreveld, A. A physiological solution for freshwater crustacea. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 34 (4), 428-432 (1936).
- Oesterle, A. . pipette cookbook. , 97 (2008).
- Fuentes-Pardo, B., Ramos-Carvajal, J. The phase response curve of electroretinographic circadian rhythm of crayfish. Comp. Biochem. Physiol. A Comp. Physiol. 74 (3), 711-714 (1983).
- Pace-Schott, E. F., Hobson, J. A. The neurobiology of sleep: genetics, cellular physiology and subcortical networks. Nat. Rev. Neurosci. 3 (8), 591-605 (2002).
- Pittendrigh, C. S., Aschoff, J. On the mechanism of the entrainment of a circadian rhythm by light cycles. Circadian Clocks. , 277-297 (1965).
- Pittendrigh, C. S., Aschoff, J. Circadian systems: entrainment. Handbook Behavioral Neurobiology Biological Rhythms. , 94-124 (1981).
- Vitaterna, M. H., Takahashi, J. S., Turek, F. W. Overview of circadian rhythms. Alcohol Res. Health. 25 (2), 85-93 (2001).
- Hille, B. . Ion channels of excitable membranes. 507, (2001).
- Dircksen, H., Strauss, J. Circadian clocks in crustaceans: identified neuronal and cellular systems. Front Biosci. 15, 1040-1074 (2010).
- Terakita, A., Hariyama, T., Tsukahara, Y., Katsukura, Y., Tashiro, H. Interaction of GTP-binding protein Gq with photoactivated rhodopsin in the photoreceptor membranes of crayfish. FEBS Lett. 330, 197-200 (1993).
- Terakita, A., Takahama, H., Hariyama, T., Suzuki, T., Tsukahara, Y. Light regulated localization of the beta-subunit of Gq-type G-protein in the crayfish photoreceptors. J Comp Physiol A. 183 (4), 411-417 (1998).
- Terakita, A., Takahama, H., Tamotsu, S., Suzuki, T., Hariyama, T., Tsukahara, Y. Light-modulated subcellular localization of the alpha-subunit of GTP-binding protein Gq in crayfish photoreceptors. Vis Neurosci. 13 (3), 539-547 (1996).
