빛 자극전달 시 가재 광수용체 의 둔감화 및 회수
Summary
circadian 시간의 함수로 가재 광수용체의 둔감 및 감도 회복에 대한 연구를 위한 프로토콜이 제시된다.
Abstract
가재 광수용체의 탈감작 및 회복을 연구하는 방법이 제시된다. 우리는 불연속 단일 전극 전환 전압 클램프 구성을 사용하여 격리 된 눈 줄기에서 광수용체 세포의 세포 내 전기 적 기록을 수행했습니다. 첫째, 면도날을 사용하여 망막에 접근하기 위해 등각막에 구멍을 내서 만들었습니다. 그 후, 우리는 개구부를 통해 유리 전극을 삽입하고, 음의 전위 기록에 의해 보고된 바와 같이 세포를 침투시켰다. 멤브레인 전위는 광수용체의 휴식 잠재력에 고정되었고 전류를 활성화하기 위해 광 펄스를 적용했습니다. 마지막으로, 두 개의 라이트 플래시 프로토콜은 현재 둔감 및 복구를 측정하기 위해 사용되었습니다. 첫 번째 라이트 플래시 트리거, 지연 기간 후, 감전 이온 전류, 이는 피크 진폭에 도달 한 후 둔감 한 상태로 붕괴; 다양한 시간 간격으로 적용되는 두 번째 플래시는 광 활성화 전도도의 상태를 평가합니다. 빛 유도 전류를 특성화하기 위해, 세 가지 매개 변수를 측정했다: 1) 대기 시간 (광 플래시 전달과 전류가 최대 값의 10 %를 달성하는 순간 사이의 경과 시간); 2) 피크 전류; 및 3) 둔감화 시간 상수(현재 감쇠 단계의 지수 시간 상수). 모든 파라미터는 첫 번째 펄스의 영향을 받습니다.
탈감작으로부터의 회복을 정량화하기 위해, p2/p1의 비율을 펄스 사이의 시간 대 사용하였다. p1은 제1 광 펄스에 의해 유발되는 피크 전류이고, p2는 제2 펄스에 의해 유발되는 피크 전류이다. 이러한 데이터는 지수 함수의 합계에 맞습니다. 마지막으로, 이러한 측정은 일주기 시간의 함수로서 수행되었다.
Introduction
시각적 자극으로 인식되려면 눈에 도달하는 빛을 전기 신호로 변환해야 합니다. 따라서 모든 시각적 유기체에서 빛은 형질 전환 이온 전류를 유발하여 광수용체 세포의 막 전위, 소위 수용체 전위변화를 일으킵니다. 이 로 인해, 눈의 빛 감도는 주로 활성화 되거나 탈감 될 수 있는 빛 활성화 전도도의 상태에 따라 달라 집니다.
가재 광수용체에서 빛은 느리고 일시적인 이온 전류1을유발합니다. 조명시, 감전 전류는 최대에 도달하기 전에 지연 또는 대기 시간 후에 발생합니다. 그 후, 감쇠 채널은 더 빛자극에응답하지 않는 둔감 한 상태로 떨어질 때 붕괴 2 . 즉, 빛은 시력을 담당하는 형질전환 전류를 활성화하는 것 외에도, 광수용체 세포의 감도의 일시적인 감소도 유도한다. 둔감은 적절한 자극에 과다 노출에 대한 일반적인 보호 메커니즘을 나타낼 수 있습니다. 감전 전도가 둔감에서 회복됨에 따라 빛에 대한 눈의 민감도가 회복됩니다.
세포내 기록은 흥분성 세포의 전기 적 활성을 측정하는 데 유용한기술이다3,4,5,6,7,8. 세포내 기록은 패치 클램프 기술9의출현으로 덜 빈번해졌지만, 세포가 분리하기 어렵거나 패치 클램핑 기가 씰의 형성을 어렵게 만드는 기하학을 제시할 때 여전히 편리한 접근법입니다(즉, 패치 전극과 10의 전기 저항을가진 패치 전극과 멤브레인 사이의 단단한 접촉). 후자의 예는 정자세포(10)와 광수용체 세포가 본원에 연구되어 있다. 우리의 경험에서, Procambarus clarkii 광수용기는 1 차적인 문화에서 격리하고 지키기 어렵습니다; 또한 기가 씰 형성을 달성하기 어렵게 만드는 얇은 막대입니다. 세포 내 기록에서 날카로운 전극은 주변 조직에 의해 제자리에 보관되는 세포로 진행됩니다. 전극은 증폭기의 고속 스위칭 회로에 의해 절단되므로 전류는 전압 펄스 사이에서 샘플링됩니다. 이 모드는 불연속 단일 전극 전압 클램프(dSEVC 모드)11로알려져 있다. 전극의 높은 저항 (작은 개구부)은 세포와 파이펫 용액 사이의 확산 교환을 방해하여 세포 내밀리외3의 최소한의 교란을 생성합니다. 이 기술의 잠재적인 단점은 전극 삽입이 비선택적 누수 전류를 생성할 수 있다는 것입니다. 따라서 누수 전류의 크기가 의도 된측정을방해 할 수있는 셀에서 기록을 피하기 위해주의를 기울여야합니다4,12.
본 명세서에서, 우리는 전압 클램프 조건하에서 광수용체 세포의 세포내 전기적 기록을 수행함으로써 광 활성화 이온 전도도의 둔감화 및 회수를 평가하기 위해 고립된 가재 눈줄기를 사용한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
가재는 비자연적 조건에서 살아남을 수있는 능력으로 인해 우수한 모델로 입증되었습니다. 생체 내 및 체외 전기 생리학적 분석에 쉽게 접근할 수 있습니다. 또한 갑각류는 비교 연대기21의 분야에서 신경 생물학적 연구에 유리한 그룹입니다.
이 논문에서는 가재 광수용체 세포의 광 활성화 형질전환 전류의 탈감작 및 회복에 대한 연구가 세포?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 DGAPA-UNAM IN224616-RN224616 교부금에 의해 지원되었습니다. 저자는 이 원고의 영어 버전을 편집한 UNAM의 디비시온 드 인베티가시온(División de Investigación)의 과학 논문 번역 부서장인 요세피나 볼라도(Josefina Bolado) 여사에게 감사를 표하고 자합니다.
Materials
| Axoclamp2A | Axon Instruments Inc | Amplifier | |
| Digidata 1200 Interface | Axon Instruments Inc | Digitizer | |
| Oscilloscope TDS430A | Tektronix | Analogic Oscilloscope | |
| Photostimulator PS33 Plus | Grass | Lamp | |
| Puller PC-100 | Narishige | Micropipette Puller | |
| Puller P-97 | Sutter Instruments | Micropipette Puller | |
| Glass Capillary Tube Kimax-51 | Kimble Products | 34502 | 0.8, 1.10, 100 mm |
| HS-2 Headstage | Axon Instruments Inc | Headstage | |
| Micromanipulator MX-4 | Narishige | Mechanical Micromanipulator | |
| Stereoscopic Microscope | Zeiss | Microscope | |
| pClamp | Axon Instruments Inc | Data acquisition software for digidata 1200 interface | |
| Clampfit | Axon Instruments Inc | Analysis software linked to pClamp | |
| Origin | OriginLab Corp. | Data analysis and graphing software | |
| Sodium Chloride | Sigma | S7653 | >99.5% |
| Potassium Chloride | Sigma | P-9333 | Minimum 99% |
| Magnesium Sulfate | Sigma | M7506 | Minimum 99.5% |
| Calcium Chloride | Sigma | C5080 | Minimum 99.0% |
| Hepes | Sigma | H7523 | >99.5% |
| Sodium Hydroxide | Sigma | S8045 | 98.00% |
| Sodium hypochlorite solution | Sigma | 425044 | Available chlorine, 10-15% |
References
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