Desensibilización y recuperación de fotorreceptores de cangrejo de río tras la entrega de un estímulo ligero
Summary
Se presenta un protocolo para el estudio de la desensibilización y la recuperación de la sensibilidad de los fotorreceptores de cangrejo sin efecto en función del tiempo circadiano.
Abstract
Se presenta un método para estudiar la desensibilización y recuperación de fotorreceptores de cangrejos. Realizamos grabaciones eléctricas intracelulares de células fotorreceptoras en miradas aisladas utilizando la configuración discontinua de abrazadera de voltaje conmutada por electrodo único. Primero, con una cuchilla de afeitar hicimos una abertura en la córnea dorsal para tener acceso a la retina. A partir de entonces, insertamos un electrodo de vidrio a través de la abertura, y penetramos en una célula según lo reportado por la grabación de un potencial negativo. El potencial de membrana se afianzó al potencial de reposo del fotorreceptor y se aplicó un pulso de luz para activar las corrientes. Por último, se empleó el protocolo de dos flashes de luz para medir la desensibilización y recuperación actuales. El primer destello de luz desencadena, después de un período de retraso, la corriente iónica de transducción, que después de alcanzar una amplitud máxima se descompone hacia un estado desensifiado; el segundo flash, aplicado en intervalos de tiempo variables, evalúa el estado de la conductividad activada por luz. Para caracterizar la corriente iluminada, se midieron tres parámetros: 1) latencia (el tiempo transcurrido entre la entrega del flash de luz y el momento en el que la corriente alcanza el 10% de su valor máximo); 2) corriente pico; y 3) constante de tiempo de desensibilización (constante de tiempo exponencial de la fase de decaimiento actual). Todos los parámetros se ven afectados por el primer pulso.
Para cuantificar la recuperación de la desensibilización, se empleó la relación p2/p1 frente al tiempo entre pulsos. p1 es la corriente pico evocada por el primer pulso de luz, y p2 es la corriente pico evocada por el segundo pulso. Estos datos se instalaron en una suma de funciones exponenciales. Finalmente, estas mediciones se llevaron a cabo en función del tiempo circadiano.
Introduction
Para ser percibido como un estímulo visual, la luz que llega a los ojos debe ser transducida en una señal eléctrica. Por lo tanto, en todos los organismos visuales, la luz desencadena una corriente iónnica de transducción, que a su vez produce un cambio en el potencial de membrana de las células fotorreceptoras, el llamado potencial receptor. Debido a esto, la sensibilidad a la luz del ojo depende principalmente del estado de la conductancia activada por la luz, que puede estar disponible para ser activada o insinotada.
En los fotorreceptores de cangrejo de río, la luz desencadena una corriente iónica lenta, transitoria1. Tras la iluminación, la corriente de transducción surge después de un retraso o latencia antes de alcanzar su máximo; a partir de entonces se descompone, ya que los canales de transducción caen en un estado desensensible en el que no responden a un estímulo de luz adicional2. Es decir, la luz, además de activar la corriente de transducción responsable de la visión, también induce un decremento transitorio de la sensibilidad de las células fotorreceptoras. La desensibilización puede representar un mecanismo de protección general contra la sobreexposición a un estímulo adecuado. La sensibilidad del ojo a la luz se recupera a medida que la conductancia de transducción se recupera de la desensibilización.
El registro intracelular es una técnica útil para medir la actividad eléctrica de las células excitables3,4,5,6,7,8. Aunque la grabación intracelular se ha vuelto menos frecuente con la llegada de la técnica de abrazadera de parche9, sigue siendo un enfoque conveniente cuando las células son difíciles de aislar, o presentar una geometría que hace difícil la formación de los sellos giga de sujeción de parches(es decir,sellos o contactos estrechos entre el electrodo de parche y las membranas con resistencia eléctrica del orden de 109ohmios). Ejemplos de estos últimos son las células espermáticas10 y las células fotorreceptoras aquí estudiadas. En nuestra experiencia, los fotorreceptores Procambarus clarkii son difíciles de aislar y mantener en la cultura primaria; además, son varillas delgadas que dificultan la formación de giga-sello. En las grabaciones intracelulares, un electrodo afilado se introduce en una célula que se mantiene en su lugar por el tejido circundante. El electrodo es cortado por el circuito de conmutación de alta velocidad del amplificador, por lo que la corriente se muestrea entre pulsos de voltaje. Este modo se conoce como abrazadera de voltaje de un solo electrodo discontinuo (modo dSEVC)11. La alta resistencia (pequeña apertura) del electrodo dificulta el intercambio de difusión entre la célula y las soluciones de pipetas, produciendo una mínima perturbación del entorno intracelular3. Un inconveniente potencial de esta técnica es que la inserción de electrodos puede producir una corriente de fuga no selectiva; por lo tanto, se debe tener cuidado de evitar el registro de las células donde el tamaño de la corriente de fuga puede interferir con las mediciones previstas4,12.
En este documento, utilizamos acechadores aislados de cangrejos para evaluar la desensibilización y recuperación de la conductancia iónica activada por la luz mediante la realización de registros eléctricos intracelulares de células fotorreceptoras en condiciones de abrazadera de tensión.
Protocol
Representative Results
Discussion
El cangrejo de río ha demostrado ser un excelente modelo debido a su capacidad para sobrevivir en condiciones no naturales. Hay fácil acceso a análisis electrofisiológicos in vivo e in vitro. Además, los crustáceos son un grupo favorable para la investigación neurobiológica en el campo de la cronobiología comparativa21.
En este artículo, el estudio de la desensibilización y recuperación de la corriente de transducción activada por la luz d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por la subvención DGAPA-UNAM IN224616-RN224616. Los autores quieren agradecer a la Sra. Josefina Bolado, Jefa del Departamento de Traducción de Documentos Científicos, de la División de Investigación de la Facultad de Medicina de la UNAM, unaM, por editar la versión en inglés de este manuscrito.
Materials
| Axoclamp2A | Axon Instruments Inc | Amplifier | |
| Digidata 1200 Interface | Axon Instruments Inc | Digitizer | |
| Oscilloscope TDS430A | Tektronix | Analogic Oscilloscope | |
| Photostimulator PS33 Plus | Grass | Lamp | |
| Puller PC-100 | Narishige | Micropipette Puller | |
| Puller P-97 | Sutter Instruments | Micropipette Puller | |
| Glass Capillary Tube Kimax-51 | Kimble Products | 34502 | 0.8, 1.10, 100 mm |
| HS-2 Headstage | Axon Instruments Inc | Headstage | |
| Micromanipulator MX-4 | Narishige | Mechanical Micromanipulator | |
| Stereoscopic Microscope | Zeiss | Microscope | |
| pClamp | Axon Instruments Inc | Data acquisition software for digidata 1200 interface | |
| Clampfit | Axon Instruments Inc | Analysis software linked to pClamp | |
| Origin | OriginLab Corp. | Data analysis and graphing software | |
| Sodium Chloride | Sigma | S7653 | >99.5% |
| Potassium Chloride | Sigma | P-9333 | Minimum 99% |
| Magnesium Sulfate | Sigma | M7506 | Minimum 99.5% |
| Calcium Chloride | Sigma | C5080 | Minimum 99.0% |
| Hepes | Sigma | H7523 | >99.5% |
| Sodium Hydroxide | Sigma | S8045 | 98.00% |
| Sodium hypochlorite solution | Sigma | 425044 | Available chlorine, 10-15% |
References
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