Desensibilizzazione e recupero dei fotorecettori dei gamberi al momento della consegna di uno stimolo leggero
Summary
Viene presentato un protocollo per lo studio della desensibilizzazione e del recupero di sensibilità dei fotorecettori dei gamberi in funzione del tempo circadiano.
Abstract
Viene presentato un metodo per studiare la desensibilità e il recupero dei fotorecettori dei gamberi. Abbiamo eseguito registrazioni elettriche intracellulari di cellule fotorecettrici in occhi con occhi isolati utilizzando la configurazione discontinua del morsetto a tensione a commutazione di elettrodi. In primo luogo, con una lama di rasoio abbiamo fatto un’apertura nella cornea dorsale per ottenere l’accesso alla retina. Successivamente, abbiamo inserito un elettrodo di vetro attraverso l’apertura e siamo penetrati in una cella come riportato dalla registrazione di un potenziale negativo. Il potenziale della membrana è stato bloccato al potenziale di riposo del fotorecettore ed è stato applicato un impulso luminoso per attivare le correnti. Infine, il protocollo light-flash è stato impiegato per misurare l’attuale desensibilizzazione e recupero. Il primo lampo di luce innesca, dopo un periodo di ritardo, la corrente ionica di trasduzione, che dopo aver raggiunto un picco di ampiezza decade verso uno stato desensibilizzato; il secondo flash, applicato a intervalli di tempo variabili, valuta lo stato della conduttanza attivata dalla luce. Per caratterizzare la corrente luminosa, sono stati misurati tre parametri: 1) latenza (il tempo trascorso tra la consegna del flash di luce e il momento in cui la corrente raggiunge il 10% del suo valore massimo); 2) corrente di picco; e 3) costante del tempo di desensibilità (costante temporale esponenziale della fase di decadimento corrente). Tutti i parametri sono influenzati dal primo impulso.
Per quantificare il recupero dalla desensibilizzazione, è stato impiegato il rapporto p2/p1 rispetto al tempo tra gli impulsi. p1 è la corrente di picco evocata dal primo impulso luminoso, e p2 è la corrente di picco evocata dal secondo impulso. Questi dati sono stati adattati a una somma di funzioni esponenziali. Infine, queste misurazioni sono state effettuate in funzione del tempo circadiano.
Introduction
Per essere percepita come uno stimolo visivo, la luce che raggiunge gli occhi deve essere traspolata in un segnale elettrico. Quindi, in tutti gli organismi visivi, la luce innesca una corrente di ioni a trasduzione, che a sua volta produce un cambiamento nel potenziale della membrana delle cellule fotorecettrici, il cosiddetto potenziale recettore. A causa di questo, la sensibilità alla luce dell’occhio dipende principalmente dallo stato della luce attivata conduttanza, che può essere disponibile per essere attivato o desensibilizzato.
Nei fotorecettori dei gamberi, la luce innesca una corrente lenta, transitoria, ionica1. Al momento dell’illuminazione, la corrente di trasduzione si verifica dopo un ritardo o una latenza prima di raggiungere il suo massimo; successivamente decade, poiché i canali di trasduzione cadono in uno stato desensibilizzato in cui non rispondono a ulteriori stimoli luminosi2. Cioè, la luce, oltre ad attivare la corrente di trasduzione responsabile della visione, induce anche un decremento transitorio della sensibilità delle cellule fotorecettrici. La desensibilità può rappresentare un meccanismo protettivo generale contro la sovraesposizione a uno stimolo adeguato. La sensibilità dell’occhio alla luce viene recuperata man mano che la conduttanza della trasduzione si riprende dalla desensibilizzazione.
La registrazione intracellulare è una tecnica utile per misurare l’attività elettrica delle cellule eccitabili3,4,5,6,7,8. Anche se la registrazione intracellulare è diventata meno frequente con l’avvento della tecnica patch-clamp9, è ancora un approccio conveniente quando le celle sono difficili da isolare, o presentano una geometria che rende difficile la formazione delle guarnizioni giga-seal patch (cioè, sigilli o stretti contatti tra l’elettrodo patch e membrane con resistenza elettrica dell’ordine di 109ohms). Esempi di questi ultimi sono le cellule spermatozoi10 e le cellule fotorecettrici qui studiate. Nella nostra esperienza, i fotorecettori di Procambarus clarkii sono difficili da isolare e mantenere nella cultura primaria; inoltre, sono aste sottili che rendono difficile ottenere la formazione di giga-sigilli. Nelle registrazioni intracellulari, un elettrodo affilato viene avanzato in una cellula che viene mantenuta in posizione dal tessuto circostante. L’elettrodo viene tagliato dal circuito di commutazione ad alta velocità dell’amplificatore, quindi la corrente viene campionata tra gli impulsi di tensione. Questa modalità è nota come morsetto di tensione a singolo elettrodo discontinuo (modalità dSEVC)11. L’elevata resistenza (piccola apertura) dell’elettrodo ostacola lo scambio di diffusione tra la cellula e le soluzioni pipetta, producendo un disturbo minimo dell’ambiente intracellulare3. Un potenziale inconveniente di questa tecnica è che l’inserimento dell’elettrodo può produrre una corrente di perdita non selettiva; pertanto, è necessario prestare attenzione per evitare la registrazione da celle in cui le dimensioni della corrente di perdita possono interferire con le misure previste4,12.
Qui, usiamo occhi isolati di gamberi per valutare la desensibilità e il recupero della conduttanza iografica attivata dalla luce eseguendo registrazioni elettriche intracellulari di cellule fotorecettrici in condizioni di morsetto di tensione.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il gambero ha dimostrato di essere un modello eccellente grazie alla sua capacità di sopravvivere in condizioni non naturali. C’è un facile accesso alle analisi elettrofisiologiche in vivo e in vitro. Inoltre, i crostacei sono un gruppo favorevole per la ricerca neurobiologica nel campo della cronobiologia comparativa21.
In questo articolo, lo studio della desensibilità e del recupero della corrente di trasduzione attivata dalla luce delle cellule f…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto da DGAPA-UNAM IN224616-RN224616 sovvenzione. Gli autori vogliono ringraziare la signora Josefina Bolado, capo del dipartimento di traduzione scientifica della carta, da Divisiàn de Investigaciàn a Facultad de Medicina, UNAM, per aver modificato la versione in lingua inglese di questo manoscritto.
Materials
| Axoclamp2A | Axon Instruments Inc | Amplifier | |
| Digidata 1200 Interface | Axon Instruments Inc | Digitizer | |
| Oscilloscope TDS430A | Tektronix | Analogic Oscilloscope | |
| Photostimulator PS33 Plus | Grass | Lamp | |
| Puller PC-100 | Narishige | Micropipette Puller | |
| Puller P-97 | Sutter Instruments | Micropipette Puller | |
| Glass Capillary Tube Kimax-51 | Kimble Products | 34502 | 0.8, 1.10, 100 mm |
| HS-2 Headstage | Axon Instruments Inc | Headstage | |
| Micromanipulator MX-4 | Narishige | Mechanical Micromanipulator | |
| Stereoscopic Microscope | Zeiss | Microscope | |
| pClamp | Axon Instruments Inc | Data acquisition software for digidata 1200 interface | |
| Clampfit | Axon Instruments Inc | Analysis software linked to pClamp | |
| Origin | OriginLab Corp. | Data analysis and graphing software | |
| Sodium Chloride | Sigma | S7653 | >99.5% |
| Potassium Chloride | Sigma | P-9333 | Minimum 99% |
| Magnesium Sulfate | Sigma | M7506 | Minimum 99.5% |
| Calcium Chloride | Sigma | C5080 | Minimum 99.0% |
| Hepes | Sigma | H7523 | >99.5% |
| Sodium Hydroxide | Sigma | S8045 | 98.00% |
| Sodium hypochlorite solution | Sigma | 425044 | Available chlorine, 10-15% |
References
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