光刺激の送達時のザリガニ光受容体の脱感作と回復
Summary
概日時間の関数としてのザリガニ光受容体の脱感作と感度回復の研究のためのプロトコルが提示される。
Abstract
ザリガニ光受容体の脱感作と回収を研究する方法を提示する。不連続な単一電極交換電圧クランプ構成を用いて、単離されたアイズトークにおける光受容体細胞の細胞内電気記録を行った。まず、カミソリの刃で、網膜へのアクセスを得るために、後角膜に開口部を作りました。その後、開口部を通してガラス電極を挿入し、負電位の記録により報告された細胞を貫通した。膜電位は、光受容体の休止電位でクランプされ、電流を活性化するために光パルスを適用した。最後に、2つのライトフラッシュプロトコルを用いて、現在の脱感作と回復を測定しました。最初のライトフラッシュトリガは、ラグ期間の後、転起イオン電流、ピーク振幅に達した後、脱感作状態に向かって減衰します。2番目のフラッシュは、様々な時間間隔で適用され、光活性化導電率の状態を評価する。光誘発電流を特徴付けるために、1)遅延(ライトフラッシュ配信と電流が最大値の10%を達成するまでの経過時間)の3つのパラメータを測定しました。2)ピーク電流;3)脱感作時間定数(現在の減衰相の指数時間定数)。すべてのパラメータは、最初のパルスの影響を受けます。
脱感作からの回復を定量化するために、比p2/p1はパルス間の時間と比較して採用された。p1は第1の光パルスによって呼び起こされるピーク電流であり、p2は第2パルスによって呼び起こされるピーク電流である。これらのデータは、指数関数の合計に適合しました。最後に、これらの測定は概日時間の関数として行った。
Introduction
視覚刺激として知覚されるためには、眼に到達する光を電気信号に形質転換する必要があります。したがって、すべての視覚生物において、光は形質転換イオン電流を引き起こし、光受容体細胞の膜電位、いわゆる受容体電位の変化を引き起こす。このため、眼の光感度は、主に光活性化導電率の状態に依存し、活性化または脱感作することができます。
ザリガニの光受容体では、光はゆっくりとした一過性のイオン電流1を引き起こす。照明時に、転移電流は、最大に達する前に遅れまたは遅延の後に発生します。その後、それは減衰し、伝達チャネルが脱感作状態に陥り、それらはさらなる光刺激に応答しない2。すなわち、光は、視覚を担う形質転換電流を活性化することに加えて、感光体細胞の感受性の一過性の減少も誘導する。脱感作は、適切な刺激への過度の暴露に対する一般的な保護メカニズムを表し得る。転帰伝導が脱感作から回復するにつれて、光に対する眼の感受性が回復する。
細胞内記録は、興奮性細胞3、4、5、6、7、8の電気活動を測定するのに有用な技術である。パッチクランプ技術9の出現により細胞内記録の頻度は低くなっていますが、細胞が単離しにくい場合や、パッチクランプギガシールの形成を困難にする幾何学的形状(すなわち、パッチ電極と膜間のシールまたは接合が109オームの電気抵抗を伴う)を提示する場合には、依然として便利なアプローチです。後者の例は、精子細胞10および本明細書で研究された光受容体細胞である。私たちの経験では、プロカンバルス・クラーキイ光受容体は単一培養中に分離し、維持することは困難です。さらに、ギガシール形成を達成しにくくする細い棒です。細胞内記録では、鋭い電極が周囲の組織によって所定の所定の場所に保持される細胞に進入される。電極はアンプの高速スイッチング回路によって切り刻まれるため、電圧パルス間で電流をサンプリングします。このモードは、不連続単電極電圧クランプ(dSEVCモード)11として知られている。電極の高抵抗(小さな開口部)は、細胞とピペット溶液との拡散交換を妨げ、細胞内ミリュー3の妨害を最小限に抑える。この技術の潜在的な欠点は、電極挿入が非選択的リーク電流を生成する可能性が高いということです。したがって、リーク電流の大きさが意図した測定値に干渉する可能性のある細胞からの記録を避けるように注意する必要があります4、12。
本明細書では、単離されたザリガニの目話を用いて、電圧クランプ条件下で光受容体細胞の細胞内電気記録を行うことにより、光活性化イオン伝導率の脱感作と回収を評価する。
Protocol
Representative Results
Discussion
ザリガニは、非自然条件下で生き残る能力のために優れたモデルであることが証明されています。インビボおよびインビトロ電気生理学的分析への容易なアクセスがある。また、甲殻類は、比較時間生物学21の分野における神経生物学的研究に有利な群である。
本論文では、ザリガニ光受容体細胞の光活性化伝達電流の脱感作と回収に関す…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作業は、DGAPA-UNAM IN224616-RN224616 補助金によってサポートされました。著者たちは、この原稿の英語版を編集するために、UNAMのナカルト・デ・メディチーナのディビシオン・デ・インベスティガシオンの科学論文翻訳部門長のジョセフィーナ・ボラド夫人に感謝したいと考えています。
Materials
| Axoclamp2A | Axon Instruments Inc | Amplifier | |
| Digidata 1200 Interface | Axon Instruments Inc | Digitizer | |
| Oscilloscope TDS430A | Tektronix | Analogic Oscilloscope | |
| Photostimulator PS33 Plus | Grass | Lamp | |
| Puller PC-100 | Narishige | Micropipette Puller | |
| Puller P-97 | Sutter Instruments | Micropipette Puller | |
| Glass Capillary Tube Kimax-51 | Kimble Products | 34502 | 0.8, 1.10, 100 mm |
| HS-2 Headstage | Axon Instruments Inc | Headstage | |
| Micromanipulator MX-4 | Narishige | Mechanical Micromanipulator | |
| Stereoscopic Microscope | Zeiss | Microscope | |
| pClamp | Axon Instruments Inc | Data acquisition software for digidata 1200 interface | |
| Clampfit | Axon Instruments Inc | Analysis software linked to pClamp | |
| Origin | OriginLab Corp. | Data analysis and graphing software | |
| Sodium Chloride | Sigma | S7653 | >99.5% |
| Potassium Chloride | Sigma | P-9333 | Minimum 99% |
| Magnesium Sulfate | Sigma | M7506 | Minimum 99.5% |
| Calcium Chloride | Sigma | C5080 | Minimum 99.0% |
| Hepes | Sigma | H7523 | >99.5% |
| Sodium Hydroxide | Sigma | S8045 | 98.00% |
| Sodium hypochlorite solution | Sigma | 425044 | Available chlorine, 10-15% |
References
- Barriga-Montoya, C., Gómez-Lagunas, F., Fuentes-Pardo, B. Effect of pigment dispersing hormone on the electrical activity of crayfish visual photoreceptors during the 24-h cycle. Comp. Biochem. Physiol. A Comp. Physiol. 157 (4), 338-345 (2010).
- Barriga-Montoya, C., de la O-Martínez, A., Fuentes-Pardo, B., Gómez-Lagunas, F. Desensitization and recovery of crayfish photoreceptors. Dependency on circadian time, and pigment-dispersing hormone. Comp. Biochem. Physiol. A Comp. Physiol. 203, 297-303 (2017).
- Wickenden, A. D. Overview of electrophysiological techniques. Curr. protoc. pharmacol. 11, 1-17 (2014).
- Brette, R., Destexhe, A. Intracellular recording. Handbook of Neural Activity Measurement. , 44-91 (2012).
- Cummins, D., Goldsmith, T. H. Cellular identification of the violet receptor in the crayfish eye. J. Comp. Physiol. 142 (2), 199-202 (1981).
- Eguchi, E. Rhabdom structure and receptor potentials in single crayfish retinular cells. J. Cell and Comp. Physiol. 66, 411-430 (1965).
- Nosaki, H. Electrophysiological study of color encoding in the compound eye of crayfish, Procambarus clarkii. Z. vergl. Physiologie. 64 (3), 318-323 (1969).
- Miller, C. S., Glantz, R. M. Visual adaptation modulates a potassium conductance in retinular cells of the crayfish. Vis Neurosci. 17 (3), 353-368 (2000).
- Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflugers Arch. 391 (2), 85-100 (1981).
- Lishko, P., Clapham, D. E., Navarro, B., Kirichok, Y. Sperm patch-clamp. Methods Enzymol. 525, 59-79 (2013).
- Finkel, A. Axoclamp-2A microelectrode clamp theory and operation. Axon Instruments, Inc. , (1990).
- Sakmann, B. . Single-channel recording. , (2013).
- Van Harreveld, A. A physiological solution for freshwater crustacea. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 34 (4), 428-432 (1936).
- Oesterle, A. . pipette cookbook. , 97 (2008).
- Fuentes-Pardo, B., Ramos-Carvajal, J. The phase response curve of electroretinographic circadian rhythm of crayfish. Comp. Biochem. Physiol. A Comp. Physiol. 74 (3), 711-714 (1983).
- Pace-Schott, E. F., Hobson, J. A. The neurobiology of sleep: genetics, cellular physiology and subcortical networks. Nat. Rev. Neurosci. 3 (8), 591-605 (2002).
- Pittendrigh, C. S., Aschoff, J. On the mechanism of the entrainment of a circadian rhythm by light cycles. Circadian Clocks. , 277-297 (1965).
- Pittendrigh, C. S., Aschoff, J. Circadian systems: entrainment. Handbook Behavioral Neurobiology Biological Rhythms. , 94-124 (1981).
- Vitaterna, M. H., Takahashi, J. S., Turek, F. W. Overview of circadian rhythms. Alcohol Res. Health. 25 (2), 85-93 (2001).
- Hille, B. . Ion channels of excitable membranes. 507, (2001).
- Dircksen, H., Strauss, J. Circadian clocks in crustaceans: identified neuronal and cellular systems. Front Biosci. 15, 1040-1074 (2010).
- Terakita, A., Hariyama, T., Tsukahara, Y., Katsukura, Y., Tashiro, H. Interaction of GTP-binding protein Gq with photoactivated rhodopsin in the photoreceptor membranes of crayfish. FEBS Lett. 330, 197-200 (1993).
- Terakita, A., Takahama, H., Hariyama, T., Suzuki, T., Tsukahara, Y. Light regulated localization of the beta-subunit of Gq-type G-protein in the crayfish photoreceptors. J Comp Physiol A. 183 (4), 411-417 (1998).
- Terakita, A., Takahama, H., Tamotsu, S., Suzuki, T., Hariyama, T., Tsukahara, Y. Light-modulated subcellular localization of the alpha-subunit of GTP-binding protein Gq in crayfish photoreceptors. Vis Neurosci. 13 (3), 539-547 (1996).
