Desensibilisering og genvinding af krebs-Photoreceptorer ved levering af en let stimulus
Summary
En protokol til undersøgelse af desensibilisering og følsomhed nyttiggørelse af krebs-foto som funktion af cirkadiske tid er præsenteret.
Abstract
En metode til at studere desensibilisering og nyttiggørelse af krebs foto er præsenteret. Vi udførte intracellulære elektriske optagelser af fotoreceptor-celler i isolerede øjestalker ved hjælp af den diskontinuerlige enkelt elektrode koblede spændings klemme konfiguration. For det første, med en barberkniv gjorde vi en åbning i dorsale hornhinden for at få adgang til nethinden. Derefter indsatte vi en glaselektrode gennem åbningen og trængte ind i en celle som rapporteret ved optagelsen af et negativt potentiale. Membranpotentialet blev fastspændt på photoreceptors hvile potentiale, og der blev anvendt en lys impuls til at aktivere strømninger. Endelig var de to Light-flash-protokollen ansat til at måle nuværende desensibilisering og nyttiggørelse. Den første Light-flash udløser, efter en mellemliggende periode, den transduktionsionstrøm, som efter at have nået en spids amplitude henfalder mod en desensibiliseret tilstand; den anden blitz, der anvendes med varierende tidsintervaller, vurderer tilstanden af den lysaktiverede ledning. For at karakterisere den lys-fremkaldte strøm, tre parametre blev målt: 1) ventetid (den tid, der er gået mellem lys flash levering og det øjeblik, hvor strømmen opnår 10% af sin maksimale værdi); 2) spidsstrøm; og 3) desensibiliserings tiden konstant (eksponentiel tidskonstant for den aktuelle henfalds fase). Alle parametre påvirkes af den første puls.
For at kvantificere genfinding fra desensibilisering blev forholdet P2/P1 anvendt i forhold til tiden mellem pulser. P1 er den spidsstrøm, der er fremkaldt af den første lysimpuls, og P2 er topstrømmen fremkaldt af den anden puls. Disse data blev monteret på en sum af eksponentielle funktioner. Endelig blev disse målinger udført som funktion af cirkadiske tid.
Introduction
For at blive opfattet som en visuel stimulus, lys nå øjnene skal være transduceret ind i et elektrisk signal. Derfor, i alle visuelle organismer, lys udløser en transduktionsion-strøm, som igen producerer en ændring i membranpotentialet af fotoreceptor celler, den såkaldte receptor potentiale. På grund af dette, den lysfølsomhed af øjet primært afhænger af tilstanden af lyset aktiveret ledning, som kan enten være til rådighed til at blive aktiveret eller desensibiliseret.
I Krebs photoreceptors udløser lys en langsom, forbigående, ionisk strøm1. Ved belysning opstår transduktionsstrømmen efter en forsinkelse eller ventetid, inden den når sit maksimum. derefter henfalder det, da transduktion kanaler falde i en desensibiliseret tilstand, hvor de ikke reagerer på yderligere lys stimulus2. Det vil, ud over at aktivere transduktionsstrømmen ansvarlig for synet, også inducerer en forbigående formindskelse af følsomheden af fotoreceptor celler. Desensibilisering kan repræsentere en generel beskyttende mekanisme mod overeksponering for en passende stimulus. Øjets følsomhed over for lys er genvundet, da transduktionskonduktiviteten genopretter fra desensibilisering.
Intracellulær optagelse er en nyttig teknik til måling af elektrisk aktivitet af overgearet celler3,4,5,6,7,8. Selvom intracellulær optagelse er blevet mindre hyppig med fremkomsten af plasteret-klemme teknik9, det er stadig en bekvem tilgang, når cellerne er enten vanskelige at isolere, eller præsentere en geometri, der gør dannelsen af patch-spænde Giga-sæler vanskelige (dvs.sæler eller tætte kontakter mellem plasteret elektrode og membraner med elektrisk modstand i rækkefølgen af 109ohm). Eksempler på sidstnævnte er sædceller10 og fotoreceptor cellerne heri undersøgt. Det er vores erfaring, procambarus clarkii foto er svære at isolere og holde i primær kultur; Derudover er de tynde stænger, der gør Giga-segl dannelse vanskeligt at opnå. I intracellulære optagelser er en skarp elektrode fremskreden i en celle, der holdes på plads af det omgivende væv. Elektroden er hakket af forstærkeren højhastigheds koblings kredsløb, så der udtages prøver af strøm mellemspændings pulser. Denne tilstand er kendt som diskontinuert single-elektrode spændings klemme (dSEVC mode)11. Den høje modstand (lille åbning) af elektroden hindrer diffusions udvekslingen mellem cellen og pipette opløsningerne, hvilket giver en minimal forstyrrelse af det intracellulære Milieu3. En potentiel ulempe ved denne teknik er, at elektrodeindføring kan producere en ikke-selektiv lækage strøm; Derfor skal der udvises forsigtighed for at undgå optagelse fra celler, hvor størrelsen af lækage strømmen kan forstyrre de tilsigtede målinger4,12.
Heri bruger vi isolerede Krebs-eyestalks til at vurdere desensibilisering og genopretning af den lysaktiverede ionledning ved at udføre intracellulære elektriske optagelser af fotoreceptor-celler under spændings klemme forhold.
Protocol
Representative Results
Discussion
Krebs har vist sig at være en glimrende model på grund af dens evne til at overleve under ikke-naturlige forhold. Der er nem adgang til in vivo og in vitro elektrofysiologiske analyser. Desuden er krebsdyr en gunstig gruppe for neurobiologisk forskning inden for komparativ chronobiology21.
I dette papir, studiet af desensibilisering og nyttiggørelse af lys-aktiveret transduktion-strøm af krebs fotoreceptor celler vises ved hjælp af intracellulære…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af DGAPA-UNAM IN224616-RN224616 Grant. Forfatterne vil gerne takke Mrs. Josefina, chef for afdelingen for videnskabelig papir oversættelse, fra División de Investigación ved Facultad de Medicina, UNAM, for at have redigeret den engelsksprogede udgave af dette manuskript.
Materials
| Axoclamp2A | Axon Instruments Inc | Amplifier | |
| Digidata 1200 Interface | Axon Instruments Inc | Digitizer | |
| Oscilloscope TDS430A | Tektronix | Analogic Oscilloscope | |
| Photostimulator PS33 Plus | Grass | Lamp | |
| Puller PC-100 | Narishige | Micropipette Puller | |
| Puller P-97 | Sutter Instruments | Micropipette Puller | |
| Glass Capillary Tube Kimax-51 | Kimble Products | 34502 | 0.8, 1.10, 100 mm |
| HS-2 Headstage | Axon Instruments Inc | Headstage | |
| Micromanipulator MX-4 | Narishige | Mechanical Micromanipulator | |
| Stereoscopic Microscope | Zeiss | Microscope | |
| pClamp | Axon Instruments Inc | Data acquisition software for digidata 1200 interface | |
| Clampfit | Axon Instruments Inc | Analysis software linked to pClamp | |
| Origin | OriginLab Corp. | Data analysis and graphing software | |
| Sodium Chloride | Sigma | S7653 | >99.5% |
| Potassium Chloride | Sigma | P-9333 | Minimum 99% |
| Magnesium Sulfate | Sigma | M7506 | Minimum 99.5% |
| Calcium Chloride | Sigma | C5080 | Minimum 99.0% |
| Hepes | Sigma | H7523 | >99.5% |
| Sodium Hydroxide | Sigma | S8045 | 98.00% |
| Sodium hypochlorite solution | Sigma | 425044 | Available chlorine, 10-15% |
References
- Barriga-Montoya, C., Gómez-Lagunas, F., Fuentes-Pardo, B. Effect of pigment dispersing hormone on the electrical activity of crayfish visual photoreceptors during the 24-h cycle. Comp. Biochem. Physiol. A Comp. Physiol. 157 (4), 338-345 (2010).
- Barriga-Montoya, C., de la O-Martínez, A., Fuentes-Pardo, B., Gómez-Lagunas, F. Desensitization and recovery of crayfish photoreceptors. Dependency on circadian time, and pigment-dispersing hormone. Comp. Biochem. Physiol. A Comp. Physiol. 203, 297-303 (2017).
- Wickenden, A. D. Overview of electrophysiological techniques. Curr. protoc. pharmacol. 11, 1-17 (2014).
- Brette, R., Destexhe, A. Intracellular recording. Handbook of Neural Activity Measurement. , 44-91 (2012).
- Cummins, D., Goldsmith, T. H. Cellular identification of the violet receptor in the crayfish eye. J. Comp. Physiol. 142 (2), 199-202 (1981).
- Eguchi, E. Rhabdom structure and receptor potentials in single crayfish retinular cells. J. Cell and Comp. Physiol. 66, 411-430 (1965).
- Nosaki, H. Electrophysiological study of color encoding in the compound eye of crayfish, Procambarus clarkii. Z. vergl. Physiologie. 64 (3), 318-323 (1969).
- Miller, C. S., Glantz, R. M. Visual adaptation modulates a potassium conductance in retinular cells of the crayfish. Vis Neurosci. 17 (3), 353-368 (2000).
- Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflugers Arch. 391 (2), 85-100 (1981).
- Lishko, P., Clapham, D. E., Navarro, B., Kirichok, Y. Sperm patch-clamp. Methods Enzymol. 525, 59-79 (2013).
- Finkel, A. Axoclamp-2A microelectrode clamp theory and operation. Axon Instruments, Inc. , (1990).
- Sakmann, B. . Single-channel recording. , (2013).
- Van Harreveld, A. A physiological solution for freshwater crustacea. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 34 (4), 428-432 (1936).
- Oesterle, A. . pipette cookbook. , 97 (2008).
- Fuentes-Pardo, B., Ramos-Carvajal, J. The phase response curve of electroretinographic circadian rhythm of crayfish. Comp. Biochem. Physiol. A Comp. Physiol. 74 (3), 711-714 (1983).
- Pace-Schott, E. F., Hobson, J. A. The neurobiology of sleep: genetics, cellular physiology and subcortical networks. Nat. Rev. Neurosci. 3 (8), 591-605 (2002).
- Pittendrigh, C. S., Aschoff, J. On the mechanism of the entrainment of a circadian rhythm by light cycles. Circadian Clocks. , 277-297 (1965).
- Pittendrigh, C. S., Aschoff, J. Circadian systems: entrainment. Handbook Behavioral Neurobiology Biological Rhythms. , 94-124 (1981).
- Vitaterna, M. H., Takahashi, J. S., Turek, F. W. Overview of circadian rhythms. Alcohol Res. Health. 25 (2), 85-93 (2001).
- Hille, B. . Ion channels of excitable membranes. 507, (2001).
- Dircksen, H., Strauss, J. Circadian clocks in crustaceans: identified neuronal and cellular systems. Front Biosci. 15, 1040-1074 (2010).
- Terakita, A., Hariyama, T., Tsukahara, Y., Katsukura, Y., Tashiro, H. Interaction of GTP-binding protein Gq with photoactivated rhodopsin in the photoreceptor membranes of crayfish. FEBS Lett. 330, 197-200 (1993).
- Terakita, A., Takahama, H., Hariyama, T., Suzuki, T., Tsukahara, Y. Light regulated localization of the beta-subunit of Gq-type G-protein in the crayfish photoreceptors. J Comp Physiol A. 183 (4), 411-417 (1998).
- Terakita, A., Takahama, H., Tamotsu, S., Suzuki, T., Hariyama, T., Tsukahara, Y. Light-modulated subcellular localization of the alpha-subunit of GTP-binding protein Gq in crayfish photoreceptors. Vis Neurosci. 13 (3), 539-547 (1996).
