प्रकाश उत्तेजना के वितरण पर क्रेफ़िश फोटोरिसेप्टर्स की असंवेदनशीलता और वसूली
Summary
सर्कैडियन समय के एक समारोह के रूप में क्रेफिश फोटोरिसेप्टर्स के असंवेदनशीलता और संवेदनशीलता वसूली के अध्ययन के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया जाता है।
Abstract
क्रेफिश फोटोरिसेप्टर्स की असंवेदनशीलता और वसूली का अध्ययन करने की एक विधि प्रस्तुत की जाती है। हमने अलग-अलग आंखों में फोटोरिसेप्टर कोशिकाओं की इंट्रासेलर इलेक्ट्रिकल रिकॉर्डिंग का प्रदर्शन किया, जिसमें असतत एकल इलेक्ट्रोड-स्विच्ड वोल्टेज-क्लैंप कॉन्फ़िगरेशन का उपयोग किया गया। सबसे पहले, एक रेजर ब्लेड के साथ हमने रेटिना तक पहुंच प्राप्त करने के लिए पृष्ठीय कॉर्निया में एक खोलने बनाया। इसके बाद, हमने उद्घाटन के माध्यम से एक ग्लास इलेक्ट्रोड डाला, और नकारात्मक क्षमता की रिकॉर्डिंग द्वारा रिपोर्ट के अनुसार एक कोशिका में प्रवेश किया। झिल्ली की क्षमता फोटोरिसेप्टर की आराम करने की क्षमता पर क्लैंप किया गया था और धाराओं को सक्रिय करने के लिए एक प्रकाश-नाड़ी लागू की गई थी। अंत में, वर्तमान असंवेदीकरण और वसूली को मापने के लिए दो लाइट-फ्लैश प्रोटोकॉल को नियोजित किया गया था। पहला लाइट-फ्लैश ट्रिगर, अंतराल अवधि के बाद, ट्रांसड्यूक्शन आयनिक वर्तमान, जो एक संवेदनशील राज्य की ओर एक चोटी आयाम क्षय तक पहुंचने के बाद; दूसरा फ्लैश, अलग-अलग समय अंतराल पर लागू होता है, प्रकाश-सक्रिय आचरण की स्थिति का आकलन करता है। प्रकाश प्राप्त वर्तमान की विशेषता के लिए, तीन मापदंडों को मापा गया: 1) विलंबता (प्रकाश फ्लैश डिलीवरी और उस क्षण के बीच बीता समय जिसमें वर्तमान अपने अधिकतम मूल्य का 10% प्राप्त करता है); 2) पीक करंट; और 3) डिसेन्सिटाइजेशन समय स्थिर (वर्तमान क्षय चरण का घातीय समय स्थिर)। सभी पैरामीटर पहले नाड़ी से प्रभावित होते हैं।
असंवेदीकरण से वसूली की मात्रा निर्धारित करने के लिए, अनुपात p2/p1 दालों के बीच समय बनाम नियोजित किया गया था । p1 चोटी वर्तमान पहले प्रकाश नाड़ी द्वारा पैदा की है, और p2 चोटी दूसरी नाड़ी द्वारा पैदा की वर्तमान है । इन आंकड़ों को घातीय कार्यों के योग के लिए फिट किया गया था । अंत में, इन मापों को सर्कैडियन समय के कार्य के रूप में किया गया था।
Introduction
आदेश में एक दृश्य उत्तेजना के रूप में माना जा करने के लिए, आंखों तक पहुंचने प्रकाश एक बिजली के संकेत में स्थानांतरित किया जाना चाहिए । इसलिए, सभी दृश्य जीवों में, प्रकाश एक ट्रांसड्यूक्शन आयन-धारा को ट्रिगर करता है, जो बदले में फोटोरिसेप्टर कोशिकाओं की झिल्ली क्षमता में परिवर्तन पैदा करता है, तथाकथित रिसेप्टर क्षमता। इसके कारण, आंख की प्रकाश संवेदनशीलता मुख्य रूप से प्रकाश सक्रिय आचरण की स्थिति पर निर्भर करती है, जिसे या तो सक्रिय या असंवेदनशील होने के लिए उपलब्ध किया जा सकता है।
क्रेफ़िश फोटोरिसेप्टर्स में, प्रकाश धीमी, क्षणिक, आयनिक वर्तमान1को ट्रिगर करता है। रोशनी पर, ट्रांसक्शन वर्तमान अपने अधिकतम तक पहुंचने से पहले अंतराल या विलंबता के बाद उत्पन्न होता है; इसके बाद यह क्षय, ट्रांसड्यूक्शन चैनलों के रूप में एक असंवेदनशील राज्य में गिर जाते हैं जिसमें वे आगे प्रकाश उत्तेजना2के लिए अनुत्तरदायी हैं . यही है, दृष्टि के जिम्मेदार ट्रांसड्यूक्शन वर्तमान को सक्रिय करने के अलावा प्रकाश, फोटोरिसेप्टर कोशिकाओं की संवेदनशीलता का क्षणिक विनाश भी प्रेरित करता है। डिसेन्सिटाइजेशन पर्याप्त उत्तेजना के लिए ओवरएक्सपोजर के खिलाफ एक सामान्य सुरक्षात्मक तंत्र का प्रतिनिधित्व कर सकता है। प्रकाश के प्रति आंख की संवेदनशीलता बरामद होती है क्योंकि ट्रांसड्यूक्शन आचरण डिसिजन से ठीक हो जाता है।
इंट्रासेलर रिकॉर्डिंग एक्सीटेबल कोशिकाओं3,4,5,6,7,8की विद्युत गतिविधि को मापने के लिए एक उपयोगी तकनीक है . यद्यपि इंट्रासेलर रिकॉर्डिंग पैच-क्लैंप तकनीक9के आगमन के साथ कम बार हो गई है, यह अभी भी एक सुविधाजनक दृष्टिकोण है जब कोशिकाओं को या तो अलग करना मुश्किल होता है, या एक ज्यामिति पेश करता है जो पैच-क्लैंपिंग गीगा-सील के गठन को मुश्किल बनाता है(यानी,पैच इलेक्ट्रोड और झिल्ली के बीच 109ओह्म के आदेश के विद्युत प्रतिरोध के साथ सील या तंग संपर्क)। उत्तरार्द्ध के उदाहरण शुक्राणु कोशिकाएं10 और फोटोरिसेप्टर कोशिकाएं हैं जो यहां अध्ययन की गई हैं। हमारे अनुभव में, प्रोकैम्बस क्लार्की फोटोरिसेप्टर्स को अलग करना और प्राथमिक संस्कृति में रखना मुश्किल है; इसके अतिरिक्त, वे पतली छड़ हैं जो गीगा-सील गठन को प्राप्त करना मुश्किल बनाते हैं। इंट्रासेलर रिकॉर्डिंग में, एक तेज इलेक्ट्रोड एक कोशिका में उन्नत होता है जिसे आसपास के ऊतकों द्वारा जगह में रखा जाता है। इलेक्ट्रोड एम्पलीफायर की हाई-स्पीड स्विचिंग सर्किटरी से कटा हुआ है, इसलिए वोल्टेज दालों के बीच करंट का नमूना लिया जाता है। इस मोड को असतत एकल-इलेक्ट्रोड वोल्टेज क्लैंप (डीएसईवीसी मोड)11के रूप में जाना जाता है। इलेक्ट्रोड का उच्च प्रतिरोध (छोटा उद्घाटन) कोशिका और पिपेट समाधानों के बीच प्रसारित होने वाले आदान-प्रदान में बाधा डालता है, जिससे इंट्रासेलर परिवेश3की न्यूनतम अशांति उत्पन्न होती है। इस तकनीक की एक संभावित खामी यह है कि इलेक्ट्रोड प्रविष्टि एक गैर-चयनात्मक रिसाव वर्तमान का उत्पादन कर सकती है; इसलिए, देखभाल कोशिकाओं से रिकॉर्डिंग से बचने के लिए लिया जाना चाहिए जहां रिसाव वर्तमान के आकार इच्छित माप4,12के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं .
इसके साथ, हम वोल्टेज क्लैंप स्थितियों के तहत फोटोरिसेप्टर कोशिकाओं की इंट्रासेलर विद्युत रिकॉर्डिंग प्रदर्शन करके प्रकाश-सक्रिय आयन आचरण की असंवेदीकरण और वसूली का आकलन करने के लिए अलग-थलग क्रेफ़िश आंखों का उपयोग करते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
क्रेफ़िश गैर-प्राकृतिक परिस्थितियों में जीवित रहने की क्षमता के कारण एक उत्कृष्ट मॉडल साबित हुआ है। वीवो और इन विट्रो इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल विश्लेषणों में आसान पहुंच है। इसके अलावा, क्रस्टे?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को डीजीगा-यूएनएएम IN224616-RN224616 अनुदान का समर्थन मिला। लेखक इस पांडुलिपि के अंग्रेजी भाषा के संस्करण को संपादित करने के लिए, यूएएम के Faculión de मेडिसिना, UNAM में डिविसिओन डी Investigación से वैज्ञानिक पेपर अनुवाद विभाग की प्रमुख श्रीमती जोफिना बोलाडो का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं।
Materials
| Axoclamp2A | Axon Instruments Inc | Amplifier | |
| Digidata 1200 Interface | Axon Instruments Inc | Digitizer | |
| Oscilloscope TDS430A | Tektronix | Analogic Oscilloscope | |
| Photostimulator PS33 Plus | Grass | Lamp | |
| Puller PC-100 | Narishige | Micropipette Puller | |
| Puller P-97 | Sutter Instruments | Micropipette Puller | |
| Glass Capillary Tube Kimax-51 | Kimble Products | 34502 | 0.8, 1.10, 100 mm |
| HS-2 Headstage | Axon Instruments Inc | Headstage | |
| Micromanipulator MX-4 | Narishige | Mechanical Micromanipulator | |
| Stereoscopic Microscope | Zeiss | Microscope | |
| pClamp | Axon Instruments Inc | Data acquisition software for digidata 1200 interface | |
| Clampfit | Axon Instruments Inc | Analysis software linked to pClamp | |
| Origin | OriginLab Corp. | Data analysis and graphing software | |
| Sodium Chloride | Sigma | S7653 | >99.5% |
| Potassium Chloride | Sigma | P-9333 | Minimum 99% |
| Magnesium Sulfate | Sigma | M7506 | Minimum 99.5% |
| Calcium Chloride | Sigma | C5080 | Minimum 99.0% |
| Hepes | Sigma | H7523 | >99.5% |
| Sodium Hydroxide | Sigma | S8045 | 98.00% |
| Sodium hypochlorite solution | Sigma | 425044 | Available chlorine, 10-15% |
References
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