Desensitization og gjenoppretting av kreps Fotoreseptorene ved levering av en lys stimulans
Summary
En protokoll for studiet av desensitization og følsomhet utvinning av kreps fotoreseptorene som en funksjon av døgn er presentert.
Abstract
En metode for å studere desensitization og utvinning av kreps fotoreseptorene er presentert. Vi utførte intracellulære elektriske opptak av foto reseptoren celler i isolerte eyestalks ved hjelp av en usammenhengende konfigurasjon med én elektrode byttet spenning. Først med et barberblad lagde vi en åpning i rygg hornhinnen for å få tilgang til netthinnen. Deretter satte vi inn et glass elektrode gjennom åpningen, og penetrert en celle som rapportert av innspillingen av et negativt potensial. Membran potensialet ble klemt ved Foto reseptoren hvile potensial og en lys puls ble brukt for å aktivere strøm. Til slutt ble de to lys-Flash-protokollen ansatt for å måle dagens desensitization og utvinning. Den første lys-flash utløser, etter en lag periode, den Transduction joniske strøm, som etter å ha nådd en topp amplitude henfall mot en ufølsomme tilstand; den andre blitsen, brukt ved varierende tidsintervaller, vurderer tilstanden til den lys aktiverte konduktans. For å karakterisere lys-elicited strøm, tre parametre ble målt: 1) latency (tiden gått mellom lys blits levering og det øyeblikket hvor strømmen oppnår 10% av sin maksimale verdi); 2) topp strøm; og 3) desensitization tid konstant (eksponentiell tid konstant av gjeldende forfall fase). Alle parametere påvirkes av den første pulsen.
For å kvantifisere utvinningen fra desensitization, var forholdet P2/P1 ansatt versus tid mellom pulser. P1 er topp strømmen fremkalt av den første lys-puls, og P2 er topp strømmen fremkalt av den andre pulsen. Disse dataene ble montert til en sum av eksponentiell funksjoner. Til slutt ble disse målingene utført som funksjon av døgn.
Introduction
For å bli oppfattet som en visuell stimulans, lys når øynene må transduced til et elektrisk signal. Derfor, i alle visuelle organismer, utløser lys en Transduction ion-strøm, som igjen gir en endring i membranen potensialet i Foto reseptoren celler, den såkalte reseptor potensial. På grunn av dette avhenger lysfølsomheten i øyet hovedsakelig av tilstanden til lyset aktivert konduktans, som kan være enten tilgjengelig for å bli aktivert eller ufølsomme.
I kreps fotoreseptorene, utløser lys en langsom, forbigående, ioniske nåværende1. Ved belysning oppstår den Transduction strømmen etter et etterslep eller ventetid før den når sitt maksimum; deretter det henfall, som Transduction kanaler faller inn i en ufølsomme tilstand der de ikke svarer til ytterligere lys stimulans2. Det er, lys, i tillegg til å aktivere Transduction nåværende ansvarlig for visjonen, også induserer en forbigående reduksjon av følsomheten til Foto reseptoren celler. Desensitization kan representere en generell beskyttelsesmekanisme mot å bli en tilstrekkelig stimulans. Øyets følsomhet for lys gjenopprettes etter hvert som Transduction konduktans gjenoppretter fra desensitization.
Intracellulære innspilling er en nyttig teknikk for måling av elektrisk aktivitet i nervøs celler3,4,5,6,7,8. Selv om intracellulære innspillingen har blitt mindre hyppig med bruk av patch-Clamp teknikk9, er det fortsatt en praktisk tilnærming når cellene er enten vanskelig å isolere, eller presentere en geometri som gjør dannelsen av plasteret-klemme Giga-sel vanskelig (dvs.sel eller stramt-kontakter mellom patch elektroden og membraner med elektrisk motstand av rekkefølgen på 109Ohm). Eksempler på sistnevnte er sperm celler10 og foto reseptoren cellene her studert. I vår erfaring, Procambarus clarkii fotoreseptorene er vanskelig å isolere og holde i primær kultur; i tillegg er de tynne stenger som gjør Giga-segl formasjon vanskelig å oppnå. I intracellulære innspillinger er en skarp elektrode avansert til en celle som holdes på plass av det omgivende vevet. Elektroden er hakket av høyhastighets bytte kretsen til forsterkeren, slik at strømmen blir samplet mellom spennings pulser. Denne modusen er kjent som usammenhengende enkelt elektrode spennings klemme (dSEVC-modus)11. Den høye motstanden (liten åpning) av elektroden hindrer den diffusional utvekslingen mellom cellen og pipette-løsningene, noe som gir en minimal forstyrrelse av det intracellulære miljøet3. En potensiell ulempe med denne teknikken er at elektrode innsetting kan produsere en ikke-selektiv lekkasjestrøm; Derfor må det utvises forsiktighet for å unngå opptak fra celler der størrelsen på lekkasjestrømmen kan forstyrre de tiltenkte målingene4,12.
Heri, bruker vi isolerte kreps eyestalks å vurdere desensitization og gjenvinning av lys-aktivert ion konduktans ved å utføre intracellulære elektriske innspillinger av foto reseptoren celler under spenning klemme forhold.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kreps har vist seg å være en utmerket modell på grunn av sin evne til å overleve under ikke-naturlige forhold. Det er lett tilgang til in vivo -og in vitro -elektrofysiologisk analyser. I tillegg krepsdyr er en gunstig gruppe for nevrobiologiske forskning innen komparative chronobiology21.
I denne utredningen, studiet av desensitization og utvinning av lys aktivert Transduction av kreps Foto reseptoren celler vises ved hjelp av intracellulære inns…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av DGAPA-UNAM IN224616-RN224616 stipend. Forfatterne ønsker å takke fru Josefina Bolado, leder av Scientific Paper Translation Department, fra División de Investigación i Facultad de Medicina, UNAM, for redigering den engelskspråklige versjonen av dette manuskriptet.
Materials
| Axoclamp2A | Axon Instruments Inc | Amplifier | |
| Digidata 1200 Interface | Axon Instruments Inc | Digitizer | |
| Oscilloscope TDS430A | Tektronix | Analogic Oscilloscope | |
| Photostimulator PS33 Plus | Grass | Lamp | |
| Puller PC-100 | Narishige | Micropipette Puller | |
| Puller P-97 | Sutter Instruments | Micropipette Puller | |
| Glass Capillary Tube Kimax-51 | Kimble Products | 34502 | 0.8, 1.10, 100 mm |
| HS-2 Headstage | Axon Instruments Inc | Headstage | |
| Micromanipulator MX-4 | Narishige | Mechanical Micromanipulator | |
| Stereoscopic Microscope | Zeiss | Microscope | |
| pClamp | Axon Instruments Inc | Data acquisition software for digidata 1200 interface | |
| Clampfit | Axon Instruments Inc | Analysis software linked to pClamp | |
| Origin | OriginLab Corp. | Data analysis and graphing software | |
| Sodium Chloride | Sigma | S7653 | >99.5% |
| Potassium Chloride | Sigma | P-9333 | Minimum 99% |
| Magnesium Sulfate | Sigma | M7506 | Minimum 99.5% |
| Calcium Chloride | Sigma | C5080 | Minimum 99.0% |
| Hepes | Sigma | H7523 | >99.5% |
| Sodium Hydroxide | Sigma | S8045 | 98.00% |
| Sodium hypochlorite solution | Sigma | 425044 | Available chlorine, 10-15% |
References
- Barriga-Montoya, C., Gómez-Lagunas, F., Fuentes-Pardo, B. Effect of pigment dispersing hormone on the electrical activity of crayfish visual photoreceptors during the 24-h cycle. Comp. Biochem. Physiol. A Comp. Physiol. 157 (4), 338-345 (2010).
- Barriga-Montoya, C., de la O-Martínez, A., Fuentes-Pardo, B., Gómez-Lagunas, F. Desensitization and recovery of crayfish photoreceptors. Dependency on circadian time, and pigment-dispersing hormone. Comp. Biochem. Physiol. A Comp. Physiol. 203, 297-303 (2017).
- Wickenden, A. D. Overview of electrophysiological techniques. Curr. protoc. pharmacol. 11, 1-17 (2014).
- Brette, R., Destexhe, A. Intracellular recording. Handbook of Neural Activity Measurement. , 44-91 (2012).
- Cummins, D., Goldsmith, T. H. Cellular identification of the violet receptor in the crayfish eye. J. Comp. Physiol. 142 (2), 199-202 (1981).
- Eguchi, E. Rhabdom structure and receptor potentials in single crayfish retinular cells. J. Cell and Comp. Physiol. 66, 411-430 (1965).
- Nosaki, H. Electrophysiological study of color encoding in the compound eye of crayfish, Procambarus clarkii. Z. vergl. Physiologie. 64 (3), 318-323 (1969).
- Miller, C. S., Glantz, R. M. Visual adaptation modulates a potassium conductance in retinular cells of the crayfish. Vis Neurosci. 17 (3), 353-368 (2000).
- Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflugers Arch. 391 (2), 85-100 (1981).
- Lishko, P., Clapham, D. E., Navarro, B., Kirichok, Y. Sperm patch-clamp. Methods Enzymol. 525, 59-79 (2013).
- Finkel, A. Axoclamp-2A microelectrode clamp theory and operation. Axon Instruments, Inc. , (1990).
- Sakmann, B. . Single-channel recording. , (2013).
- Van Harreveld, A. A physiological solution for freshwater crustacea. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 34 (4), 428-432 (1936).
- Oesterle, A. . pipette cookbook. , 97 (2008).
- Fuentes-Pardo, B., Ramos-Carvajal, J. The phase response curve of electroretinographic circadian rhythm of crayfish. Comp. Biochem. Physiol. A Comp. Physiol. 74 (3), 711-714 (1983).
- Pace-Schott, E. F., Hobson, J. A. The neurobiology of sleep: genetics, cellular physiology and subcortical networks. Nat. Rev. Neurosci. 3 (8), 591-605 (2002).
- Pittendrigh, C. S., Aschoff, J. On the mechanism of the entrainment of a circadian rhythm by light cycles. Circadian Clocks. , 277-297 (1965).
- Pittendrigh, C. S., Aschoff, J. Circadian systems: entrainment. Handbook Behavioral Neurobiology Biological Rhythms. , 94-124 (1981).
- Vitaterna, M. H., Takahashi, J. S., Turek, F. W. Overview of circadian rhythms. Alcohol Res. Health. 25 (2), 85-93 (2001).
- Hille, B. . Ion channels of excitable membranes. 507, (2001).
- Dircksen, H., Strauss, J. Circadian clocks in crustaceans: identified neuronal and cellular systems. Front Biosci. 15, 1040-1074 (2010).
- Terakita, A., Hariyama, T., Tsukahara, Y., Katsukura, Y., Tashiro, H. Interaction of GTP-binding protein Gq with photoactivated rhodopsin in the photoreceptor membranes of crayfish. FEBS Lett. 330, 197-200 (1993).
- Terakita, A., Takahama, H., Hariyama, T., Suzuki, T., Tsukahara, Y. Light regulated localization of the beta-subunit of Gq-type G-protein in the crayfish photoreceptors. J Comp Physiol A. 183 (4), 411-417 (1998).
- Terakita, A., Takahama, H., Tamotsu, S., Suzuki, T., Hariyama, T., Tsukahara, Y. Light-modulated subcellular localization of the alpha-subunit of GTP-binding protein Gq in crayfish photoreceptors. Vis Neurosci. 13 (3), 539-547 (1996).
