Desensibilisering och återvinning av kräftor fotoreceptorer vid leverans av en ljus stimulans
Summary
Ett protokoll för studiet av desensibilisering och känslighet återhämtning av kräftor fotoreceptorer som en funktion av dygnsrytm tid presenteras.
Abstract
En metod för att studera desensibilisering och återhämtning av kräftor fotoreceptorer presenteras. Vi utförde intracellulära elektriska inspelningar av Rostnings celler i isolerade att med hjälp av diskontinuerliga enda elektrod-switchat spänning-klämma konfiguration. Först, med ett rakblad vi gjorde en öppning i dorsala hornhinnan för att få tillgång till näthinnan. Därefter satte vi in en glaselektrod genom öppningen, och penetrade en cell som rapporteras av inspelningen av en negativ potential. Membranpotentialen var fastspänd vid foto receptorns vilopotential och en ljus puls tillämpades för att aktivera strömmar. Slutligen var de två Light-Flash-protokollet används för att mäta nuvarande desensibilisering och återhämtning. Den första ljus-blixt utlöser, efter en fördröjning period, signaltransduktion Joniska strömmen, som efter att ha nått en topp amplitud sönderfaller mot en desensibiliserade tillstånd; den andra blixten, som appliceras med varierande tidsintervall, bedömer tillståndet för den ljusaktiverade kontruktans. För att karakterisera ljuset-framkallade ström, tre parametrar mättes: 1) latens (den tid som förflutit mellan ljus blixt leverans och det ögonblick då ström uppnår 10% av dess maximala värde); 2) toppström; och 3) desensibilisering tid konstant (exponentiell tidskonstant av den nuvarande sönderfalls fasen). Alla parametrar påverkas av den första pulsen.
För att kvantifiera återhämtning från desensibilisering, var förhållandet P2/P1 anställd kontra tid mellan pulser. P1 är toppströmmen frammanade av den första ljus-pulsen, och P2 är toppströmmen framkallat av den andra pulsen. Dessa data var monterade på en summa av exponentialfunktioner. Slutligen utfördes dessa mätningar som funktion av dygnsrytmen.
Introduction
För att uppfattas som en visuell stimulans, måste ljus som når ögonen vara omvandlas till en elektrisk signal. Därför, i alla visuella organismer, utlöser ljus en transduktion Jon ström, vilket i sin tur ger en förändring i membranet potential Rostnings celler, den så kallade receptor potential. På grund av detta, ljuskänslighet i ögat beror främst på tillståndet i ljuset aktiverad conductance, som kan antingen vara tillgängliga för att aktiveras eller desensibiliseras.
I kräftfotoreceptorer utlöser ljus en långsam, övergående, jonisk ström1. Vid belysning uppstår transduktionströmmen efter en fördröjning eller fördröjning innan den når sitt maximum. därefter sönderfaller det, som transduktionkanalerna hamnar i ett okänsligare tillstånd där de inte svarar på ytterligare ljus stimulans2. Det är, ljus, förutom att aktivera transduktion nuvarande ansvarig för synen, inducerar också en övergående minskning av känsligheten hos fotoreceptor celler. Desensibilisering kan utgöra en allmän skyddsmekanism mot överexponering för en adekvat stimulans. Ögats känslighet för ljus återvinns som transduktionconductance återhämtar sig från desensibilisering.
Intracellulär inspelning är en användbar teknik för att mäta elektrisk aktivitet av retbara celler3,4,5,6,7,8. Även om intracellulär inspelning har blivit mindre frekvent med tillkomsten av patch-Clamp teknik9, är det fortfarande en bekväm metod när cellerna är antingen svårt att isolera, eller presentera en geometri som gör bildandet av plåstret-fastspänning Giga-tätningar svårt (dvstätningar eller täta kontakter mellan plåstret elektroden och membran med elektriskt motstånd i storleksordningen 109ohm). Exempel på de senare är spermier celler10 och fotoreceptor cellerna häri studeras. Enligt vår erfarenhet, Procambarus clarkii fotoreceptorer är svåra att isolera och hålla i primärkulturen; Dessutom är de tunna stavar som gör Giga-Seal formation svårt att uppnå. I intracellulära inspelningar, en skarp elektrod är avancerad i en cell som hålls på plats av den omgivande vävnaden. Elektroden hackas av den snabba switchkretsen på förstärkaren, så ström samplas mellan spännings pulser. Detta läge är känt som diskontinuerlig enelektrod spännings klämma (dSEVC-läge)11. Den höga resistensen (liten öppning) av elektroden hindrar det diffusionella utbytet mellan cellen och pipettlösningarna, vilket ger en minimal störning av den intracellulära miljö3. En potentiell nackdel med denna teknik är att insättning av elektroden kan ge en icke-selektiv läcka ström. Därför måste försiktighet iakttas för att undvika registrering från celler där läckageströmens storlek kan störa de avsedda mätningarna4,12.
Häri använder vi isolerade kräftor att för att bedöma desensibilisering och återhämtning av ljus-aktiverade Jon värmeledningsförmåga genom att utföra intracellulära elektriska inspelningar av fotoreceptor celler under spänning klämma villkor.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kräftan har visat sig vara en utmärkt modell på grund av dess förmåga att överleva under icke-naturliga förhållanden. Det finns enkel tillgång till in vivo och in vitro elektrofysiologiska analyser. Dessutom är kräftdjur en gynnsam grupp för neurobiologisk forskning inom området komparativ chronobiology21.
I detta dokument visas studiet av desensibilisering och återhämtning av ljus-aktiverad transduktion-ström av kräftor-fotoreceptorce…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av DGAPA-UNAM IN224616-RN224616 Grant. Författarna vill tacka fru Josefina Bolado, chef för avdelningen för vetenskaplig pappers översättning, från División de Investigación på Facultad de Medicina, UNAM, för att redigera den engelskspråkiga versionen av detta manuskript.
Materials
| Axoclamp2A | Axon Instruments Inc | Amplifier | |
| Digidata 1200 Interface | Axon Instruments Inc | Digitizer | |
| Oscilloscope TDS430A | Tektronix | Analogic Oscilloscope | |
| Photostimulator PS33 Plus | Grass | Lamp | |
| Puller PC-100 | Narishige | Micropipette Puller | |
| Puller P-97 | Sutter Instruments | Micropipette Puller | |
| Glass Capillary Tube Kimax-51 | Kimble Products | 34502 | 0.8, 1.10, 100 mm |
| HS-2 Headstage | Axon Instruments Inc | Headstage | |
| Micromanipulator MX-4 | Narishige | Mechanical Micromanipulator | |
| Stereoscopic Microscope | Zeiss | Microscope | |
| pClamp | Axon Instruments Inc | Data acquisition software for digidata 1200 interface | |
| Clampfit | Axon Instruments Inc | Analysis software linked to pClamp | |
| Origin | OriginLab Corp. | Data analysis and graphing software | |
| Sodium Chloride | Sigma | S7653 | >99.5% |
| Potassium Chloride | Sigma | P-9333 | Minimum 99% |
| Magnesium Sulfate | Sigma | M7506 | Minimum 99.5% |
| Calcium Chloride | Sigma | C5080 | Minimum 99.0% |
| Hepes | Sigma | H7523 | >99.5% |
| Sodium Hydroxide | Sigma | S8045 | 98.00% |
| Sodium hypochlorite solution | Sigma | 425044 | Available chlorine, 10-15% |
References
- Barriga-Montoya, C., Gómez-Lagunas, F., Fuentes-Pardo, B. Effect of pigment dispersing hormone on the electrical activity of crayfish visual photoreceptors during the 24-h cycle. Comp. Biochem. Physiol. A Comp. Physiol. 157 (4), 338-345 (2010).
- Barriga-Montoya, C., de la O-Martínez, A., Fuentes-Pardo, B., Gómez-Lagunas, F. Desensitization and recovery of crayfish photoreceptors. Dependency on circadian time, and pigment-dispersing hormone. Comp. Biochem. Physiol. A Comp. Physiol. 203, 297-303 (2017).
- Wickenden, A. D. Overview of electrophysiological techniques. Curr. protoc. pharmacol. 11, 1-17 (2014).
- Brette, R., Destexhe, A. Intracellular recording. Handbook of Neural Activity Measurement. , 44-91 (2012).
- Cummins, D., Goldsmith, T. H. Cellular identification of the violet receptor in the crayfish eye. J. Comp. Physiol. 142 (2), 199-202 (1981).
- Eguchi, E. Rhabdom structure and receptor potentials in single crayfish retinular cells. J. Cell and Comp. Physiol. 66, 411-430 (1965).
- Nosaki, H. Electrophysiological study of color encoding in the compound eye of crayfish, Procambarus clarkii. Z. vergl. Physiologie. 64 (3), 318-323 (1969).
- Miller, C. S., Glantz, R. M. Visual adaptation modulates a potassium conductance in retinular cells of the crayfish. Vis Neurosci. 17 (3), 353-368 (2000).
- Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflugers Arch. 391 (2), 85-100 (1981).
- Lishko, P., Clapham, D. E., Navarro, B., Kirichok, Y. Sperm patch-clamp. Methods Enzymol. 525, 59-79 (2013).
- Finkel, A. Axoclamp-2A microelectrode clamp theory and operation. Axon Instruments, Inc. , (1990).
- Sakmann, B. . Single-channel recording. , (2013).
- Van Harreveld, A. A physiological solution for freshwater crustacea. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 34 (4), 428-432 (1936).
- Oesterle, A. . pipette cookbook. , 97 (2008).
- Fuentes-Pardo, B., Ramos-Carvajal, J. The phase response curve of electroretinographic circadian rhythm of crayfish. Comp. Biochem. Physiol. A Comp. Physiol. 74 (3), 711-714 (1983).
- Pace-Schott, E. F., Hobson, J. A. The neurobiology of sleep: genetics, cellular physiology and subcortical networks. Nat. Rev. Neurosci. 3 (8), 591-605 (2002).
- Pittendrigh, C. S., Aschoff, J. On the mechanism of the entrainment of a circadian rhythm by light cycles. Circadian Clocks. , 277-297 (1965).
- Pittendrigh, C. S., Aschoff, J. Circadian systems: entrainment. Handbook Behavioral Neurobiology Biological Rhythms. , 94-124 (1981).
- Vitaterna, M. H., Takahashi, J. S., Turek, F. W. Overview of circadian rhythms. Alcohol Res. Health. 25 (2), 85-93 (2001).
- Hille, B. . Ion channels of excitable membranes. 507, (2001).
- Dircksen, H., Strauss, J. Circadian clocks in crustaceans: identified neuronal and cellular systems. Front Biosci. 15, 1040-1074 (2010).
- Terakita, A., Hariyama, T., Tsukahara, Y., Katsukura, Y., Tashiro, H. Interaction of GTP-binding protein Gq with photoactivated rhodopsin in the photoreceptor membranes of crayfish. FEBS Lett. 330, 197-200 (1993).
- Terakita, A., Takahama, H., Hariyama, T., Suzuki, T., Tsukahara, Y. Light regulated localization of the beta-subunit of Gq-type G-protein in the crayfish photoreceptors. J Comp Physiol A. 183 (4), 411-417 (1998).
- Terakita, A., Takahama, H., Tamotsu, S., Suzuki, T., Hariyama, T., Tsukahara, Y. Light-modulated subcellular localization of the alpha-subunit of GTP-binding protein Gq in crayfish photoreceptors. Vis Neurosci. 13 (3), 539-547 (1996).
