Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Funktionell yta-immobilisering av gener med utgångsämnet Strand deplacement litografi

Published: October 25, 2018 doi: 10.3791/58634
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1Physics Department, Technical University of Munich
* These authors contributed equally

Summary

Vi beskriver en enkel litografiska procedur för immobilisering av gen-längd DNA-molekyler på en yta, som kan användas för att utföra cellfria gen uttryck experiment på biochips.

Abstract

Immobilisering av gener på lithographically strukturerade ytor tillåter studier av konkurrensbetingat gen uttryck processer i ett öppet mikroflödessystem bioreaktor system. Till skillnad från andra metoder mot konstgjorda cellulära system tillåter sådan inställning för kontinuerlig med gen uttryck reagenser och samtidig dränering av avfallsprodukter. Detta underlättar genomförandet av cellfria gen uttryck processer över längre tidsperioder, vilket är viktigt för förverkligandet av dynamiska gen reglerande återkopplingssystem. Här tillhandahåller vi ett detaljerat protokoll för tillverkning av genetiska biochips genom en enkel att använda litografisk teknik baserat på DNA strand deplacement reaktioner, som uteslutande använder kommersiellt tillgängliga komponenter. Vi ger också ett protokoll om integrering av konkurrensbetingat gener med ett Polydimetylsiloxan (PDMS)-baserat mikroflödessystem system. Vi visar dessutom att systemet är kompatibelt med Totalreflexion (Frida) fluorescensmikroskopi, som kan användas för direkt observation av molekylära interaktioner mellan DNA och molekyler som ingår i uttrycket mix.

Introduction

Cell-gratis genuttryck reaktioner är av stort intresse för olika applikationer i biokemi, bioteknik och syntetisk biologi. Cellfria uttrycket av proteiner var avgörande för beredning av rent protein prover, som låg till grund för ett flertal studier inom strukturbiologi. Exempelvis användes cellfria system framgångsrikt för uttrycket av protein komplex1 eller membranet proteiner2, som är svåra att producera med hjälp av cell-baserade uttryck. Noterbart cellfria genuttryck reaktioner användes också till att klarlägga den genetiska koden, börjar med den banbrytande experimenten av Nirenberg och Matthaei i 19613struktur.

Nyligen har det varit ett förnyat intresse för cellfria metoder inom bioteknik och syntetisk biologi4,5,6. Cell-gratis system kan utökas med icke-biologiska föreningar och komponenter av olika biologiska ursprung kan kombineras till lättare7. Även om cellfria system har uppenbara nackdelen att de inte ”växa och dela upp”, är det tänkbart att förbereda öppen cellfria bioreaktorer med grundläggande metaboliska funktioner och låt dem syntetisera metaboliter när medföljer enkla kol och energi ingångar8. Framväxande inom syntetisk biologi lovar cell-fria system att vara en mer förutsägbar ”chassi” för genomförandet av syntetiska biologiska funktioner.

För närvarande cellfria gen uttryck reaktioner utförs antingen med cell extrakt (från olika källor såsom bakterier, jäst, insekter), eller transkription och översättning system som var optimerad för olika tillämpningar (t.ex. prokaryota och eukaryota genuttryck, produktion av membranproteiner, etc.). Ett populärt protokoll för beredning av bakteriell cell extrakt (även kallat TXTL) lämnades nyligen av V. Noireaux och medarbetare9. Dess biofysiska egenskaper har varit grundligt kännetecknas10, och det TXTL systemet har redan använts framgångsrikt att utföra en serie komplexa biokemiska aktiviteter: exempelvis montering av funktionella bakteriofager via cellfria uttryck för phage genomet11, syntesen av bakteriell protein filament12eller genomförandet av cellfria gen kretsar13,14.

Ett annat system populära i cellfria syntetisk biologi är det ren systemet, som bereds från renade komponenter15,16. Jämfört med det TXTL systemet, innehåller det inte nukleaser eller protein nedbrytning maskiner. Samtidigt som nedbrytningen av linjära DNA är RNA-molekyler eller proteiner mindre problem i ren systemet, decay vägar är faktiskt viktigt för genomförandet av dynamiska funktioner. För att minska effekten av exonuclease nedbrytning av linjära gen mallar i systemet TXTL (genom RecBCD), har slutet-skydda GamS proteinet till vara adderat. Både TXTL och ren systemet är kommersiellt tillgängliga.

Ett ämne besläktade nära cellfria biologi oro att studera effekten av uppdelning på biokemiska reaktioner och ytterligare skapandet av konstgjorda cell-liknande strukturer eller protocells17,18,19 ,20. Forskning på konstgjorda celler oftast inkapsling av en biokemisk reaktion system inuti vesikulär fack tillverkade av fosfolipider eller andra amphiphiles. Medan sådana system hjälper till att utforska grundläggande aspekter av uppdelning, eller uppkomsten av cellularitet och självreproducerande strukturer, de möter de typiska problemen av slutna system: i avsaknad av en fungerande ämnesomsättning och lämpliga membranet transportmekanismer, det är svårt att hålla konkurrensbetingat reaktioner kör för längre tid - bränsle molekyler används upp och slaggprodukter ansamlas.

Ett intressant alternativ till olika fack inuti sådan cell-härma fack är den rumsliga organisationen av genetiskt material med photolithographic metoder. Immobilisering av ”gener på ett chip” var pionjärer av gruppen Bar-Ziv vid Weizmann Institutet mer än tio år sedan21. Bland de större frågor som hade att lösa var ospecifika adsorption av DNA och de potentiella denaturering av proteinerna på chip ytan. Bar-Ziv et al. utvecklat en dedikerad photolithography motstå kallas ”Daisy”, som bestod av en reaktiv terminal silan för immobilisering av motstå molekylerna på kiseldioxid ytor, distanshylsa lång polyetylenglykol (PEG) som säker biokompatibilitet och en photocleavable headgroup, som omvandlades till en reaktiv Amin vid bestrålning med ultraviolett (UV) ljus. Det har visats att Daisy kan användas att immobilisera gen-längd DNA-molekyler (med längder av flera kilo-baspar (kbp)) på en chip yta. Från en polymer fysik synvinkel representerade systemen polymer borstar ympade på ett fast substrat. På grund av hur polyelectrolyte DNA påverkas konformation av dessa borstar starkt av osmotisk och andra ion-specifika effekter22,23.

Viktigast av allt, har det visat att substrat-orörlig gener är fortfarande fungerande och kan transkriberas och översatt till RNA och protein. Gen borstar är tillgängliga för RNA polymeraser från lösning24och komplexa makromolekylära blandningen av transkription/översättningen är inte denatureras vid ytan. En av fördelarna med immobilisering av genetiska komponenter på ett substrat är att de kan användas i ett system av öppna mikroflödessystem-reaktorn som tillhandahålls kontinuerligt med små föregångare molekyler och från vilka restprodukter kan vara borttagna25 , 26.

Vi har nyligen utvecklat en variant av denna metod som kallas Bephore (för biokompatibla elektron-beam och fotoresist)27, som grundades uteslutande på kommersiellt tillgängliga komponenter och utnyttjas sekvens-specifika DNA strand invasion reaktioner för förverkligandet av ett enkel att implementera utgångsämnet litografi förfarande för skapandet av chip-baserade konstgjorda celler. En schematisk översikt över förfarandet visas i figur 1. Den är baserad på DNA hårnål molekyler som innehåller en photocleavable grupp, som är orörlig på ett biokompatibelt PEG-lager. Photocleavage för hårnål exponerar ett enkelsträngat fotfäste sekvens, genom vilka DNA molekyler av intresse (som innehåller sekvensen ”tränger” DIS) kan vara anslutna via fotfäste-medierad strand invasion.

Medan Bephore är potentiellt enklare att genomföra, Daisy möjliggör förverkligandet av mycket tät och ren ”genen penslar”, som har fördelar i vissa applikationer. I princip, men kan Daisy och Bephore litografi enkelt kombineras. En relaterad litografi metod utnyttjar DNA strand deplacement för att strukturera DNA borstar på guld har tidigare utvecklats av Huang et al., men var inte utnyttjas i samband med cellfria gen uttryck28,29.

I följande protokoll ger vi en detaljerad beskrivning av produktionen av DNA borstar för cellfria genuttryck med metoden Bephore. Vi beskriver hur genen chips tillverkas och demonstrera användningen av flera steg foto-litografi för rumsligt strukturerad immobilisering av gener på ett chip. Vi diskuterar också tillverkning av reaktion chambers och tillämpningen av mikrofluidik för utförandet av på-chip gen uttryck reaktioner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Obs: En tidsplan för stegen i de olika avsnitten ges kompletterande uppgifter (avsnitt 1) i.

1. chip Fabrication

Obs: som substrat, användning kiselskivor (diameter 100 mm, tjocklek 0,525 mm) med en 50 nm tjocka lager av kiseldioxid eller objektglas (24 mm x 24 mm, nr 1,5; 22 mm x 50 mm, nr 4). Beroende på applikation, kan andra storlekar och tjocklekar vara mer lämplig.

  1. Rengöring av substrat via en RCA-rengör förfarande (vatten, ammoniak NH3(aq) 30% och väteperoxid H2O2 30%, i förhållandet 5:1:1)
    1. Blanda vatten och ammoniak lösning i en bägare-glas, och värm blandningen till 70 ° C på en värmeplatta under omrörning.
    2. Lägg till väteperoxid och substrat. För högre genomströmning, placera flera substrat (särskilt små glas-bilder) i en polytetrafluoreten (PTFE) hållare.
    3. Efter 30 min, ta ut substratet, skölj den ordentligt med vatten från en tvättflaska och torka den med en kväve-pistol. Omedelbart fortsätta med pegylering av substratet.
      FÖRSIKTIGHET: Bär hud och ögonskydd och arbeta i dragskåp. Stäng inte behållaren tätt för att möjliggöra gasutsläpp från blandningen.
  2. Pegylering av substratet
    Obs: Upprepad frysning och upptining av Biotin-PEG-Silane beståndet minskar Reaktiviteten hos silan på grund av kondensation av luftfuktigheten. Därför förbereda 5 mL-rör med lämpliga mängder Biotin-PEG-silan (t.ex. 10-20 mg) och fyll dem med torr argon före frysning dem fram till användning.
    1. Lös Biotin-PEG-Silane i torr toluen av vortexa (5 mg/mL).
    2. Placera substratet i en glas petriskål (120 cm i diameter, höjd 2 cm) i ett dragskåp.
    3. Pipettera lösningen (≈200 µL för ett enda glas täckglas, några mL för en stor kisel wafer) på substratet, som täcker hela ytan, men undvika lösningen rinner över kanten på substratet.
    4. Stäng petriskål. För att minska uttorkning av substratet, lägga till ett ytterligare skydd med en våt pappershandduk.
    5. Efter 30 min, tillsätt ca 40 ml isopropylalkohol, och sedan ta ut substratet, skölj igen med isopropylalkohol och torka den med en kväve pistol (för objektglas, minns den pegylerat-sidan). Förvaras mörkt underlaget fram till användning.
      FÖRSIKTIGHET: Bär hud och ögonskydd och arbeta i dragskåp.

2. förberedelse av gener för immobilisering

Obs: Primer sekvenser, DNA modifieringar och en exemplarisk PCR-protokoll ges kompletterande uppgifter (avsnitt 2-4) i.

  1. Använda modifierade primers för att förstärka gen av intresse av polymeras-kedjereaktion (PCR). En primer bär en fluorophore för visualisering i fluorescensmikroskopi, och andra primern är separerad från DIS sekvensen av distanshylsa t.ex glykol för att hålla sekvensen DIS enkelsträngat hela PCR.
  2. Rena DNA med en spin kolumn rening kit och mäta dess koncentration med hjälp av en absorption fotometer. Koncentrationen bör inte vara mycket lägre än 100 nM.
  3. Justera koncentrationen av NaCl till 1 M med en koncentrerad 5 M NaCl lösning. Den höga saltkoncentrationen underlättar DNA borsten församling process22.

3. photolithography

Obs: Photocleavable DNA (PC) ska hanteras endast i ett gult ljus miljö. Gula folie för renrum kan användas för att filtrera ljuset av konventionella vita ljus lampor.

  1. Förberedelse av underlaget
    1. Förbereda Bephore-mixen (1 µM streptividin, 1,5 µM PC DNA, 7,5 µM PH DNA i 1 x PBS (fosfatbuffrad koksaltlösning)) och den passivering blanda (10 µM omärkt DIS DNA, 1 mg/mL BSA (bovint serum albumin), i 1 x PBS). Båda kan lagras i mörker i kylen i flera veckor.
    2. Skär substratet i mindre bitar (några cm2) antingen med hjälp av en glas fräs eller genom att bryta en silicon wafer längs en crystal linje genom att pressa på en kant med en skalpell. Som en enkel justeringsmärket, skapa en kort repa från center mot en kant av substratet med en glas fräs. Blåsa små partiklar av chip med en kväve-pistol.
    3. Blanda två droppar av tvåkomponents silikon lim, omrörning det e.g. med en pipettspetsen, och applicera limmet på ytan av chip, lämnar området runt spetsen av scratch tomt (figur 2A). Limmet ger en hydrofoba barriär som underlättar tvätt steg och minskar mängden DNA som krävs för inkubationer. I ett senare steg, kan limmet enkelt skalas.
    4. Inkubera 10 µL (eller så mycket som krävs för att täcka chip) av Bephore-blandning i rumstemperatur (RT) på chip. Under inkubationstiden, plats chip i en låda, e.g. en pipett tip låda delvis fyllda med vatten för att minska avdunstningen.
    5. Efter 1 h, tvätta chip obundna flera gånger (5 x med 50 µL) av pipettering med 1 x PBS ta bort Bephore-mix.
    6. Ta bort så mycket buffert som möjligt utan att torka chip och inkubera 10 µL av passivering-blandning på chip på RT.
    7. Efter 2 h, tvätta chip flera gånger (10 x med 50 µL) av pipettering med 1 x PBS ta bort obundna passivering agenter.
  2. Projektion litografi
    Obs: För litografi, ett upprätt Mikroskop med en 60 x vatten nedsänkning mål kan användas. Belysning gånger beror på syftet, ljuskällan, masken, substrat (kisel chip eller glas Skjut) och önskad DNA yta densitet. Med ett 60 x mål, typiska exponeringstiderna varierade underifrån en minut för en två-stegs litografi med överlappande regioner (15 s för kisel chips, 45 s för objektglas) till 2-3 min för en full exponering. Använd inte ett täckglas (utom smält kvarts) ovanpå underlaget, eftersom det blockerar UV-ljus.
    1. Skär en tryckt photomasken (se kompletterande fil med exemplarisk litografi masker och kompletterande avsnitt 5) till en lämplig storlek för att passa en lämplig mask hållare, som kan sättas in vid position i fältet stopp (figur 2B). För exakt flerstegs litografi, justera masken med justering märken på innehavaren.
    2. Placera substratet i en mikroskopi bild och flytta det till Mikroskop scenen. För mallning av Bephore glasskivor, infoga svart folie (t.ex. extra folie från den tryckta fotomasker) mellan mikroskopi bild och Bephore slide att ge en bakgrund för litografi.
    3. Infoga ett rött filter i sökvägen belysning, fokus på substrat yta och navigera till regionen i underlaget, som kommer att utsättas, e.g. regionen på spetsen av scratch.
    4. Sätt masken korthållaren, blockera belysning och ändra till UV-filter (figur 2 c). På en låg ljusintensitet, öppna slutaren och använda kameran att snabbt fokusera masken på substratet.
    5. Blockerar ljusbanan till kameran och lysa substratet på en hög ljusintensitet för önskad exponeringstiden.
    6. Ta provet från mikroskopet och avlägsna försiktigt så mycket buffert som möjligt från underlaget utan att torka.
    7. Tillsätt 10-20 µL av DNA med DIS-sekvens. Placera substratet i en våt rutan för att hålla den från att torka. Inkubera DNA på substraten för 2 h (oligonukleotider vid mikromolära koncentrationer) eller flera timmar/övernattning (kbp-långa DNA vid ca 100 nM koncentration) på RT.
    8. Ta bort DNA från chip och tvätta flera gånger med 1 x PBS. För att minska avfallet av DNA (särskilt för längre fragment), lagra DNA tas från underlaget och återanvända den.
  3. Flera steg litografi
    Anmärkning: För exakt uppriktning av två eller flera exponeringar i ett enda område, förvara provet på scenen för att undvika vinkel. Kontrollera att chipet inte torkar. För positionering av flera DNA borstar i olika regioner på ett substrat, Använd en motoriserad scenen att köra att det angivna området eller Använd ett substrat med lämplig justering markerar.
    1. Efter den första exponeringen (avsnitt 3.2), inkubera DNA med DIS-sekvens på substratet. Det är viktigt att alla bindande platser som härrör från den första exponeringen är upptagna. Därför Inkubera oligonukleotider (10 µM) för cirka 3 h på RT.
    2. För att immobilisera dis-märkta gener, placera dem på substratet för flera timmar eller övernattning på RT, sedan tvätta provet och Lägg passivering mixen för en annan 2 h på RT. Fortsätt med nästa exponering.
    3. Upprepa föregående steg för ytterligare exponeringar, (3.2.3 - 3.3.2).

4. PDMS enheter

Obs: Fungera företrädesvis i ett renrum. Tillverkning av en PDMS enhet följer ett standardprotokoll såsom beskrivits av McDonald et al. 30

  1. Tillverkning av master formar via photolithography
    1. Rengör en silicon wafer (76,2 mm diameter, 525 µm tjocklek) av ultraljudsbehandling i aceton för 5 min på hög effekt och skölj med isopropylalkohol och avjoniserat vatten. Därefter placera rånet på en värmeplatta vid 150 ° C i 15 min.
    2. Alternativt, för att förbättra vidhäftningen av motstå att rånet, lägga till 2-3 mL vidhäftning promotorn och snurra vid 3000 rpm 30 s. värme rånet till 120 ° C under 2 minuter.
    3. Lägga till cirka 2-3 mL fotoresist (se Tabell för material). Snurra rånet för 15 s på 500 rpm, sedan vid 3000 rpm för 30 s. Detta bör resultera i en 20 µm tjockt lager av fotoresist. Låt fotoresist lagret koppla av i rumstemperatur i 10 min.
    4. För den pre-exponering baka, placera rånet på en värmeplatta vid 50 ° C i 2 min, sedan vid 85 ° C i 5 min.
    5. Placera rånet under photomasken med blåkopian för facken. Helst använda en mask-aligner. Photomasken bör ha en upplösning på 64 000 dpi (se kompletterande fil med litografi masker och kompletterande avsnitt 5).
    6. Exponera rånet för 1 min med UV-ljus (I-line 5-10 mW/cm2) genom fotomask.
    7. För de efter exponering baka, placera rånet vid 50 ° C i 2 min och sedan vid 85 ° C i 5 min. Låt rånet kyla ner och koppla av för 1 h i rumstemperatur.
    8. Placera rånet i en maträtt med utvecklare för 3 min medan försiktigt agitera bägaren. Skölj rånet med isopropylalkohol och torka den med en kväve-pistol. Placera rånet på en värmeplatta vid 130 ° C i 45 min.
  2. Beredning av PDMS enheten
    1. Blanda PDMS base och PDMS härdare i förhållandet 10:1 och häll den på rånet i en stängd behållare tills ett lager med ca 5 mm har bildas ovanför rånet. För att erhålla en PDMS-enhet för bara 1 mm tjocklek, istället snurra coat rånet med PDMS vid 100 rpm i 2 min.
    2. Placera behållaren i en exsickator och tillämpa ett vakuum (ca 85 kPa) i ca 30 min. Värm sedan, PDMS till ca 70° C för 1-2 h i ugn.
    3. Separata PDMS enheten från rånet. Skär PDMS i plattor så att varje stycke innehåller en uppsättning fack. Ifall PDMS kommer att anslutas till en mikroflödessystem setup, stansa hål (diameter 1 mm) som ett inlopp och utlopp i ändarna av kanalen leverans.
    4. Rengör PDMS med isopropylalkohol och avjoniserat vatten och torka den med en kväve-pistol. Lagra de PDMS dammfri.

5. konkurrensbetingat genuttryck

Obs: I följande procedur beskrivs monteringen av en provhållare (figur 3) för observationen av konkurrensbetingat genuttryck på ett inverterat Mikroskop med en bur inkubator för temperaturkontroll. Hållaren byggdes med lättillgängliga material och verktyg (3,5-5 mm tjock polyvinylklorid (PVC) plast, skruvar och muttrar, borr) och kan anpassas för att passa olika typer av Mikroskop. Stegen som beskrivs i 5.1 och 5.2 skall utföras så att båda delarna av innehavaren är redo på samma gång.

  1. Botten innehavaren församling
    1. Förbereda ett Bephore chip med justeringsmärket (t.ex. en repa) och limma den på chip innehavaren använder dubbelhäftande tejp (figur 3B). Chipet ska vara större än PDMS enheten som kommer att täcka den.
    2. Immobilisera en eller flera gener på chip (se avsnitt 2 och 3).
    3. Lägg några vakuum fett runt hål i mitten av innehavaren av botten, och Anslut sedan innehavaren chip.
      Obs: Chip innehavaren nu följer innehavaren botten med hjälp av fettet, men behåller möjligheten för omplacering av chip i x-y-planet.
  2. Översta innehavaren församling
    1. Förbereda en tunn PDMS-chip med fack hjälp av spin beläggning proceduren i steg 4.2.1. Skär den PDMS så liten som möjligt, lämna en kanal öppen åt sidan för att möjliggöra utbyte av avfall och föregångaren molekyler genom diffusion.
    2. Rengör en glas täckglas (24 mm x 24 mm, nr 1,5) och baksidan av PDMS chip (sida utan fack) med syre plasma för 42 s (drivs på 200 W och 0.8 mbar med provet i en Faradays bur).
    3. Placera den PDMS marker i mitten av glasskiva med de fack som pekar uppåt. Baka glaset med PDMS för 1 h vid 70 ° C.
    4. Lägg några vakuum fett runt det stora hålet av innehavaren av topp.
    5. Innan du börjar experimentet, rena glas bilden och PDMS chip med syre plasma för 42 s att återge PDMS hydrofil.
    6. Placera glasskiva med PDMS på övre hållaren ( figur 3 c) och tryck försiktigt glaset på fettet (figur 3 c).
  3. Innehavaren församling
    1. Förbereda 100 µL av en cell-fria uttryck systemet och hålla det på is.
    2. Försiktigt bort bufferten från chip och tvätta den en gång med 10 µL av cellfria uttryck systemet. Nästa, tillsätt 60 µL av cellfria uttryck systemet på chipet och ta bort tvåkomponents silikon lim från kanterna av chip (redan flyttat i figur 3B).
    3. Tillsätt 20 µL av uttrycket systemet på PDMS. Efter att placera droplet-programmet på PDMS, snabbt kontrollera i stereoskopisk Mikroskop att facken är väl blöta och utan luftbubblor. Om det finns luftbubblor, försöka tvätta dem med resten av cellfria uttryck systemet.
    4. Att montera två bitar av innehavaren och för att justera chambers och DNA borstar, arbeta i stereoskopisk Mikroskop och immobilisera nedre hållaren med en gripper arm, så de två skruvarna och vingmuttrarna är lättillgängliga med båda händerna (figur 3D-F ).
    5. Sätt hållaren topp i nedre hållaren och sänka den tills cellfria uttryck systemet droppar säkring (figur 3D). Kolla igenom stereoskopisk Mikroskop om fack och justeringsmärket är i en liknande region i x-y-planet, annars dra upp övre hållaren och förnyad ställning glaset Skjut på hållaren topp.
    6. Från botten, skruva upp vingmuttrarna tills de rör undersidan av innehavaren. Dra åt vingmuttrarna, medan justera facken och chip i den x-y-plane via handtaget längst av innehavaren av chip (figur 3E). En gång i kontakten, dra åt vingmuttrarna endast mycket försiktigt (figur 3F).
      Obs: Detta steg kräver viss erfarenhet och beror på den experimentella setup. Under mikroskopet, kan interferensmönster som följd av vätska mellan PDMS och glas indikera att den tillämpliga kraften är för liten, medan en lägre fluorescensintensiteten (från en DNA-borste eller uttryckta proteiner) i mitten av en kupé tips på en för hög trycket (se även kompletterande information, avsnitt 6).
    7. Spray svampen i anti avdunstning kapsling med vatten och sätt korthållaren i rutan. Fyll en 5 mL spruta med tvåkomponents silikon lim och använda den för att försegla lådan (figur 3 g).
    8. Överföra rutan till en temperatur-kontrollerad mikroskopet och bild DNA borsten och reaktionen i fluorescensmikroskopi. Även utan belysning tonar fluorescensen av DNA borsten i en cell-fria uttryck systemet. Dock behåller penseln sin verksamhet, som kan visas genom upprepade genuttryck från samma borste.
      Obs: När du använder en Bephore glasskiva istället för en silicon chip, ställning (översta/nedersta) PDMS och Bephore chip kan bytas, vilket möjliggör användning av mål med mindre arbeta avstånd.

6. ihållande uttryck i ultrakalla enheter

Obs: Experimentell installationen monteras från de delar som visas i figur 4A. Detaljer på montering av temperaturreglerade scenen ges i den kompletterande informationen (avsnitt 7).

  1. Cellfria uttryck systemet och slangar
    1. Förbereda cellfria uttryck systemet på prov tub (ca 200 µL). Polystyren pärlor märkta med fluorescerande färgämnen kan läggas till senare övervaka flödet genom en leverans kanal.
    2. Anslut röret till en tryckregulator. Placera röret i en stor is reservoar som håller kall i ca 12 timmar. Fyll på isen om det behövs.
      Obs: Som ett alternativ till en tryckregulator, en sprutpump ger ett konstant flöde av cellfria uttryck systemet även om flödet motstånd ändringarna, t.ex. på grund av luftbubblor, som kan hjälpa med långsiktiga experiment.
    3. Anslut röret som innehåller cellfria uttryck systemet att PTFE slangar (inre diameter 0,8 mm), som når till uppvärmd scenen. Bryta en sprutans nål (diameter på 0.9 mm) i 1-2 cm bitar med trubbiga ändar och sätt in en bit i PTFE-slangen. Det fungerar senare som anslutning till PDMS. Försök att minimera längden på slangen mellan scenen och röret (figur 4 c).
    4. För att kyla PTFE-slangen, vira den runt större gummi slang som är ansluten till en is vattenreservoar och en Peristaltisk pump. Tejpa dem tillsammans med Scotch tejp (figur 4 c).
  2. Översta innehavaren församling
    1. Rengör den platta sidan av PDMS chip med syre plasma (42 s) och placera den på en mikroskopi bild med hål passande inlopp och utlopp i PDMS (figur 4B). Hålen i glaset kan borras i förväg med ett glas borra huvudet. Kontrollera att mikro-avdelningar inte står inför glasskiva.
    2. Gälla den platta sidan av innehavaren av PDMS dubbelhäftande tejp. Sticka en bit svart folie (t.ex. från en litografi mask) i regionen mellan de två hålen av innehavaren att undvika bakgrund fluorescens från tejpen.
    3. Sticka glasskiva med PDMS chip till innehavaren.
    4. Behandla PDMS och innehavaren av PDMS med bifogade glas skjut med syre plasma i plasma renare (42 s).
    5. Vakuum smörj runt det stora hålet i övre hållaren och sätt PDMS korthållaren (figur 4B). Innehavaren av PDMS följer nu topp innehavaren, men behåller möjligheten för omplacering i x-y riktningar.
    6. Anslut PTFE-slangen med spruta nål kopplingen till inloppet av PDMS chip. För att underlätta tillgång till PDMS genom övre hållaren, kan den övre plastiska plattan tas kort för detta och följande steg.
    7. Infoga en andra PTFE slangar (ca 5 cm) med spruta nål kontakt i uttaget (figur 4 d).
    8. Placera hållaren PDMS i övre hållaren så det är gratis att flytta i alla riktningar. Plats topp innehavaren löst på uppvärmd scenen som i figur 4E utan skärpning alla vingmuttrarna.
    9. Med mikroskopet, navigera till placera av PDMS facken och centrerar dem i kamerans synfält. Flytta inte scenen från denna punkt.
    10. Ta bort övre hållaren med PDMS från scenen.
  3. Uppvärmd scenen och Bephore glasskiva
    1. Ställa in temperaturen i den uppvärmda scenen till 37 ° C
    2. Limma en Bephore glasskiva (nr 4) med gene borstarna till tempererad scenen av inverterad fluorescens Mikroskop med dubbelhäftande tejp, med justeringsmärket ungefär på mitten av mikroskopets synfält. Denna placering av justeringsmärket säkerställer att facken sänks ungefär till samma region.
    3. Ta en bild i motsvarande fluorescens kanal av genen borsten och markera dess position i kamerabilden.
    4. Ta bort bufferten från gen borsten, men inte låta det gå torr. Tillsätt 20 µL av cell - yttrandefrihet systemet i gen borsten och använda pincett för att ta bort ramen silikon lim.
  4. Montering av mikrofabricerade
    1. Lägg till trycket till provet röret tills det cell-free uttryck systemet har fylld PTFE-slangen och visas längst ned på PDMS enheten. Dessutom Pipettera 10 µL av cellfria uttryck systemet på mikro-avdelningarna på PDMS. Kontrollera fack är fri från luftbubblor.
    2. Sänk övre hållaren på en glasskiva försiktigt och justera mikro-avdelningar med gen borsten. Innan både PDMS och justering mark når samma fokalplan, använda de små skruvarna på baksidan av hållaren för PDMS att exakt justera x-y-position och orientering av PDMS enheten med gen borsten (figur 4E).
    3. Håll positionen och tryck PDMS in i glas-bilden genom att dra åt vingmuttrarna längs skruvarna som Anslut övre hållaren till Mikroskop scenen (figur 4E).
    4. Öka trycket i tuben som innehåller cellfria uttryck systemet och övervaka flödet av fluorescerande pärlorna genom leverans kanalen (flöde priser mellan 0,5 till 5 µl per timme rekommenderas) (figur 4F). Om nödvändigt, öka trycket av PDMS på glaset genom att skärpa vingmuttrarna.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Två-stegs litografi: figur 5 visar resultatet av en litografisk tvåstegsprocess på en glasskiva med överlappande mönster av fluorescently märkt DIS strandar.

Uttryck för en fluorescerande protein från en gen borste: figur 6 visar uttrycket av fluorescerande protein YPet från immobiliserade DNA. På flera punkter i tid bedömde vi andelen gen uttryck genom blekning delvis fluorescerande proteinet och observera återvinning av fluorescens signalen, bortsett från omedelbar indrivning, vilket inte leder från proteinuttryck. Efter första blekningen på två timmar av uttryck, fluorescensintensiteten återhämtade sig snabbt och steg över dess värde före blekning. Efter fyra och sex timmar återställde fluorescensen inte till dess tidigare intensitet, som anger att reaktionen utan leverans av färska uttryck mix, avslutas efter ca 3-4 h.

Koppling till mikrofluidik: genuttryck kan upprätthållas över längre tid genom att leverera uttryck facken med ytterligare föregångare molekyler via mikrofluidik. Figur 7 visar ett sådant system gör det möjligt för uttrycket av YPet över 10 h.

Frida observation: Bephore kan också användas för att studera interaktionen mellan fluorescently märkta proteiner och DNA borste på nivån enda molekyl. Särskilt i en bullrig miljö, litografi hjälper till att skilja mellan specifika och ospecifika interaktion med borsten eller ytan, respektive. Figur 8 ger ett exempel, med fluorescently märkta T7 RNA-polymeras bindande eller följa prioriterat DNA borsten jämfört med den omgivande ytan.

Figure 1
Figur 1 : Bephore photolithography. A. ett substrat med en yta av kiseldioxid (SiO2) är täckt med ett lager av biotinylerade polyetylenglykol (PEG-bt), som är biokompatibla och möjliggör fastsättning av en photocleavable DNA hårnål via Biotin-streptividin interaktioner. Här, PC innehåller sekvensen domäner abcb * och en photocleavable ändring (lila stjärna) och är hybridiseras till delen PH med domän en *. B. ultraviolett (UV) belysning klyver PC, släppa en DNA-fragment (cb *) i lösning. C-D. Den resulterande enkelsträngat regionen på PC (b) aids som ett fotfäste för förskjutning av PH av en fluorescently märkt (grön stjärna) DIS strand. E. längre, dubbelsträngat DNA (”mall”) kan även kopplas till den mönstrade ytan. Sådant DNA är förberedd med PCR med en primer som transporterar en DIS-sekvens på dess 5' slut, där primer och DIS avgränsas med en tiethylene glykol spacer att hålla DIS enkelsträngat under PCR (se även kompletterande information, avsnitt 2-4). Klicka här för att se en större version av denna siffra. 

Figure 2
Figur 2 : Provberedning för photolithography. A. placera en Bephore marker med ett monteringsmärke på en mikroskopi bild eller ett annat chip hållare (t.ex. innehavaren i figur 3B). Applicera tvåkomponents silikon lim som en hydrofoba barriär längs kanterna av chip (steg 3.1.2-3). B. placera masken på en mask hållare. Här, vi bort iris i fältet stopp och modifierade innehavaren så att masken kan hållas av små magneter. För exakt (Kantiga) anpassning i flera steg litografi, se till att justering markerar på innehavaren och mask matchen (steg 3.2.1). C. för att navigera på chip och justera masken med justering markerar på chip, Skjut in den röda filtret. För de UV-exponeringen, infoga UV-filter (steg 3.2.2-5). Figur återges från den stödjande Information tidigare arbete27. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3 : Montering av hållare för observationen av konkurrensbetingat genuttryck. A. delar av innehavaren (linjalen enhet: cm). B-C. Övre och nedre delen av hållaren monteras separat, med botten innehavaren medför en mönstrad Bephore chip (se avsnitt 5.1) och övre hållaren bär en PDMS chip med fack (se avsnitt 5.2). D-F. Chip och PDMS förs försiktigt in i tät kontakt, medan samtidigt observerar och justera fack och DNA borstar i stereoskopisk Mikroskop (steg 5.3.1-6). G. innan du överför innehavaren till en inverterad, tempererad Mikroskop, hela systemet är inkapslad i en anti avdunstning box (steg 5.3.7-8). Figur återges från den stödjande Information tidigare arbete27. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4 : Mikroflödessystem setup och prov hållare för konkurrensbetingat genuttrycket. A. delar av provhållaren, PDMS enheten, tempererad Mikroskop scenen och den Bephore glasskiva (linjalen enhet: cm). B. en mikroskopi bild bär PDMS med fack är limmade till innehavaren PDMS och utsätts för syre plasma tillsammans med PDMS i plasma renare. PDMS infogas sedan i övre hållaren (steg 6.2.2-5). C. cellfria uttryck system röret är ansluten till en tryckregulator och placeras på is. Slangen (röd streckad linje i infällt) för cellfria uttryck systemet kyls av gummi slangar (blå streckad linje) genom vilken isvatten pumpas genom en Peristaltisk pump (avsnitt 6.1). D. Slangen är ansluten till inlopp position på PDMS enheten. En annan bit av slangen är ansluten till uttaget (steg 6.2.6-7). E. övre hållaren placeras på Mikroskop scenen och noggrant sänkte mot den Bephore bilden. PDMS innehavaren kan fortfarande flyttas i x-y-planet att anpassa facken i PDMS med gen borsten på Bephore chip. Vingmuttrarna används för att trycka PDMS på Bephore chip och fixa den övre hållaren till Mikroskop scenen (steg 6.4.1-3). F. cellfria uttryck systemet pumpas genom mikro-kanaler i PDMS och genuttryck från DNA borstar kan övervakas i epifluorescence mikroskopi (6.4.4 steg). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5 : Två steg photolithography. A-B. Fluorescently märkt oligonukleotider (grön: ATTO 532; red: Alexa Fluor 647) var i följd immobiliserade på en Bephore glas bild via mask projektion litografi med exponeringstiderna 45 s. C. Överlagring av subfigures A och B, visar exakt justering av de enda exponeringarna. Skala barer: 10 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6 : Uppdelade genuttryck. A. A DNA borsten på en Bephore glasskiva (UV exponeringstid: 2 min), kodning för fluorescerande protein YPet arrangera i rak linje med en kupé på ett PDMS chip (se avsnitt 5 och figur 3). B. genuttryck i kammaren med DNA gav en stark fluorescens-signal med en koncentrationsgradient för protein som bildas längs en kanal som ansluten kammaren till uttryck mixen utanför PDMS enheten. Kontroll kammaren utan immobiliserade gener förblev relativt mörka. C. fluorescens intensiteten profil över tiden för båda kamrarna. Varannan timme fluorescerande proteinet var delvis blekt (svarta pilar) att kontrollera huruvida uttrycket var fortfarande aktiv. Efter 4 h återställde fluorescensen inte till dess tidigare intensitet, som anger att uttrycket hade avslutat. Skala barer: 300 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 7
Figur 7 : Ihållande konkurrensbetingat genuttryck. A. A DNA borsten på en Bephore glasskiva (UV exponeringstid: 2 min), kodning för YPet var i linje med en kupé på ett PDMS-chip. Facken är anslutna till en leverans kanal (vit pil) genom vilken cellfria uttryck systemet pumpas (se avsnitt 6 och figur 4). B. facket som innehåller genen borsten visar en fluorescens signal från YPet uttryck (i grönt) av cellfria gen uttryck systemet. Den angränsande facket utan en gen borste förblir relativt mörk. Färska komponenter cellfria uttryck flöda genom kanalen leverans och diffunderar in i fack, medan avfallsprodukter transporteras bort. C. fluorescens intensiteten profil över tiden för båda kamrarna. De fluorescerande proteinerna var delvis blekt vid olika punkter i tiden (svarta pilar) för att kontrollera om uttryck var fortfarande aktiv. På grund av flöde i kanalen leverans upprätthölls genuttryck under minst 10 h. (topp i röd spårningen präglas av den röda pilen orsakades av en luftbubbla som tillfälligt dräneras lösningen från fack). Skala barer: 50 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 8
Figur 8 : Singel-molekyl studier på Bephore glas diabilder i totalreflexion fluorescensmikroskopi (TIRFM). A. mål-typ TIRFM möjliggör singel-molekyl imaging nära gränssnittet glas-vatten. Vi orörlig fluorescently märkt gener (grön, ATTO 532, UV exponeringstid: 2 min) med en T7 promotorn längs lithographically definieras ränder och observerade beteendet hos T7 RNA-polymeras (orange, märkt med Alexa Fluor 647) interagera med ytan. B. fluorescens bild visar två ränder av immobiliserade gener. C. T7 RNA polymeraser bifoga specifikt och icke-specifikt till ytan (bild, 50 ms exponeringstiden). D. En genomsnittlig bild som erhållits från alla ramar av en video fluorescens (5.000 ramar som i subfigure C) exponerar RNApolymerasen specifik interaktion med DNA borsten. Skala barer: 10 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bephore litografi är en robust och mångsidig teknik för mönstrade immobilisering av DNA eller RNA. Men förfarandet omfattar flera steg, som - om ändrat - kan vara en källa för misslyckande eller minskat systemets prestanda.

Ett avgörande steg i tillverkningen av Bephore marker är pegylering av substratet, vilket ger biokompatibiliteten av ytan. Här är steget rengöring med en RCA-förfarandet viktigt, eftersom det aktiverar också ytan för den efterföljande silanisering. Under det faktiska pegylering, måste underlaget inte torka ut. Dessutom måste den silan-PEG-Biotin lagras korrekt att bevara dess reaktivitet (avsnitt 1.2) och undvika crosslinking. För att bedöma resultatet av pegylering, kan substrat inkuberas med fluorescently märkta streptividin och jämfört med icke-pegylerat kontroller. Framgångsrikt bör pegylerat substrat binda betydligt mer streptividin än kontrollerna.

Även i senare skeden av litografiska processen har torkning av chip negativa effekter, t.ex. i avlägsnandet av redan bundna DNA eller i en högre adsorption av DNA till oexponerade regionerna på substratet.

Som nämnts ovan (avsnitt 3.2), upplösning litografiska processen och de nödvändiga exponeringstiderna beror på den experimentella setup (mål, ljuskälla, etc.). Därför, i ett första steg, ett brett utbud av exponeringstider bör testas.

För gen uttryck experiment, bör experimentell installationen anpassas för att passa den tillgängliga maskinvaran (Mikroskop, temperaturkontroll, etc.). Vi visade två sådana implementeringar, en för kort experiment (4 h, avsnitt 5), där systemet var inkapslad i en ruta för att minska avdunstningen av uttrycket mixen, och en för lång observation (avsnitt 6), där en mikroflödessystem enhet aktiverats en kontinuerlig leverans av föregångare molekyler. I båda fallen anpassningen av DNA borstar på substratet och fack i PDMS representerade det svåraste steget. Vi rekommenderar därför försöker detta steg flera gånger med en dummy substrat innan med en mönstrad en (se även kompletterande information, avsnitt 6). Vid montering av stora system av distinkta gen kan penslar, långa inkubationstider, exakt kantiga anpassning av kamrarna och borstar över långa avstånd, och förorening genom adsorption av DNA till icke-mönstrad regioner beroende på kvaliteten på passivering, innebära begränsningar för storleken av praktiskt genomförbart system.

Ett alternativ till denna teknik visades av Karzbrun et al. 25, som skapade fack i ett chip av induktivt kopplad plasma reaktiva-Jon etsning (Bosch-processen), följt av plasma-förbättrade förångningsdeposition (PECVD) av ett kiseldioxid lager. Efter ytan funktionalisering, mallning och placering av nliter DNA droppar av en pipettering robot stängdes i fack med en PDMS-täckt glasskiva. Detta förfarande har fördelen att DNA kan immobiliseras direkt inuti facken utan faran av kontaminerande i närheten chambers, men det kräver ytterligare fabrikation steg och laboratorieutrustning.

Det protokoll som presenteras här kan forskarna i cellfria syntetisk biologi att överföra sina system av studie från lösning-baserade uppställningar till chip-baserade reaktion behållare. Utnyttja DNA strand förskjutning som centrala steg under utvecklingen av resist möjliggör märkning av utsatta regioner med unika DNA-sekvenser, vilket ger en lättköpt strategi gentemot biokompatibla utgångsämnet litografi. Kombination med mikrofluidik tillåter observation av gen uttryck processer över längre tidsperioder. Bortsett från utredningen av cellfria gen uttryck bearbetar under öppet flöde reaktorn villkorar, skulle samma metod kunna användas att immobilisera och rumsligt organisera andra biomolekyler på en chip yta. Detta bör vara till nytta för ett brett utbud av funktionella och biofysiska studier, såsom fluorescens-baserade single-molekyl experimenten visade här.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar att de har inga konkurrerande intressen.

Acknowledgments

Vi erkänner tacksamt ekonomiskt stöd för detta projekt av den Volkswagen Stiftung (grant nr 89 883) och European Research Council (grant avtal nr 694410 - AEDNA). M.S.-S. erkänner stöd av DFGEN genom GRK 2062.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Silicon wafer with 50 nm silicon dioxide (Bephore substrate) Siegert Wafer Thickness (µm): 525 ±25, Diameter (mm): 100
Silicon wafer (for PDMS master mold) Siegert Wafer Thickness (µm): 525 ±25, Diameter (mm): 76.2 (3”)
Glass slides no. 4 Menzel 22 mm x 50 mm
Glass slides no. 1.5 Assistent 24 mm x 24 mm
Biotin-PEG-Silane Laysan Bio MW 5,000
Anhydrous toluene Sigma Aldrich (Merck) 244511
Streptavidin Thermo-Fisher Scientific S888
DNA Integrated DNA Technologies (IDT)
Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer New England Biolabs M0531S PCR kit
Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System  Promega A9281 Spin-column PCR clean-up kit
PURExpress New England Biolabs E6800S Cell-free expression system
PDMS  Dow Corning Slygard 184
FluoSpheres Thermo-Fisher Scientific F8771
PTFE tubing (ID: 0.8mm, OD: 1.6 mm) Bola S 1810-10
EpoCore 20 micro resist technology GmbH Photoresist
mr-Dev 600 micro resist technology GmbH Photoresist developer
Ti-Prime MicroChemicals Adhesion promoter
Two-component silicon glue Picodent Twinsil 
UV-protection yellow foil Lithoprotect (via MicroChemicals) Y520E212
Equipment
Masks for photolithography Zitzmann GmbH 64.000 dpi, 180x240 mm
Upright microscope Olympus BX51 Photolithography and fluorescence imaging
60x water immersion objective Olympus LumPlanFl Used with Olympus BX51, NA 0.9
20x water immersion objective Olympus LumPlanFl Used with Olympus BX51, NA 0.5
Camera Photometrics Coolsnap HQ Used with Olympus BX51
Ligtht source EXFO X-Cite 120Q Used with Olympus BX51
Inverted microscope Nikon Ti2-E Fluorescence imaging of gene expression
4x objective Nikon CFI P-Apo 4x Lambda Used with Nikon Ti2-E
Camera Andor Neo5.5 Used with Nikon Ti2-E
Light source Lumencor SOLA SM II Used with Nikon Ti2-E
Cage incubator Okolab bold line Used with Nikon Ti2-E
Pressure Controller Elveflow OB1 MK3
NanoPhotometer Implen DNA concentration measurement
Plasma cleaner Diener Femto 200 W, operated at 0.8 mbar with the sample in a Faraday cage

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Heyman, Y., Buxboim, A., Wolf, S. G., Daube, S. S., Bar-Ziv, R. H. Cell-free protein synthesis and assembly on a biochip. Nature Nanotechnology. 7 (6), 374-378 (2012).
  2. Jaehme, M., Michel, H. Evaluation of cell-free protein synthesis for the crystallization of membrane proteins - a case study on a member of the glutamate transporter family from Staphylothermus marinus. The FEBS Journal. 280 (4), 1112-1125 (2013).
  3. Nirenberg, M. W., Matthaei, J. H. The dependence of cell-free protein synthesis in E. coli upon naturally occurring or synthetic polyribonucleotides. Proceedings Of The National Academy Of Sciences Of The United States Of America. 47, 1588-1602 (1961).
  4. Harris, D. C., Jewett, M. C. Cell-free biology: exploiting the interface between synthetic biology and synthetic chemistry. Current Opinion in Biotechnology. 23 (5), 672-678 (2012).
  5. Hodgman, C. E., Jewett, M. C. Cell-free synthetic biology: Thinking outside the cell. Metabolic Engineering. 14 (3), 261-269 (2012).
  6. Smith, M. T., Wilding, K. M., Hunt, J. M., Bennett, A. M., Bundy, B. C. The emerging age of cell-free synthetic biology. FEBS Letters. 588 (17), 2755-2761 (2014).
  7. Estévez-Torres, A., et al. Sequence-independent and reversible photocontrol of transcription/expression systems using a photosensitive nucleic acid binder. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (30), 12219-12223 (2009).
  8. Opgenorth, P. H., Korman, T. P., Bowie, J. U. A synthetic biochemistry molecular purge valve module that maintains redox balance. Nature Communications. 5 (1), 4113 (2014).
  9. Sun, Z. Z., et al. Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology. Journal of Visualized Experiments. (79), e50762 (2013).
  10. Karzbrun, E., Shin, J., Bar-Ziv, R. H., Noireaux, V. Coarse-Grained Dynamics of Protein Synthesis in a Cell-Free System. Physical Review Letters. 106 (4), 048104 (2011).
  11. Shin, J., Jardine, P., Noireaux, V. Genome replication, synthesis, and assembly of the bacteriophage T7 in a single cell-free reaction. ACS Synthetic Biology. 1 (9), 408-413 (2012).
  12. Maeda, Y. T., et al. Assembly of MreB filaments on liposome membranes: a synthetic biology approach. ACS Synthetic Biology. 1 (2), 53-59 (2012).
  13. Shin, J., Noireaux, V. An E. coli Cell-Free Expression Toolbox: Application to Synthetic Gene Circuits and Artificial Cells. ACS Synthetic Biology. 1 (1), 29-41 (2012).
  14. Niederholtmeyer, H., et al. Rapid cell-free forward engineering of novel genetic ring oscillators. eLife. 4, e09771 (2015).
  15. Shimizu, Y., et al. Cell-free translation reconstituted with purified components. Nature Biotechnology. 19 (8), 751-755 (2001).
  16. Shimizu, Y., Kanamori, T., Ueda, T. Protein synthesis by pure translation systems. Methods. 36 (3), 299-304 (2005).
  17. Pohorille, A., Deamer, D. Artificial cells: prospects for biotechnology. Trends In Biotechnology. 20 (3), 123-128 (2002).
  18. Adamala, K. P., Martin-Alarcon, D. A., Guthrie-Honea, K. R., Boyden, E. S. Engineering genetic circuit interactions within and between synthetic minimal cells. Nature Chemistry. 9 (5), 431-439 (2017).
  19. Tan, C., Saurabh, S., Bruchez, M. P., Schwartz, R., Leduc, P. Molecular crowding shapes gene expression in synthetic cellular nanosystems. Nature Nanotechnology. 8 (8), 602-608 (2013).
  20. van Nies, P., et al. Self-replication of DNA by its encoded proteins in liposome-based synthetic cells. Nature Communications. 9 (1), 1583 (2018).
  21. Buxboim, A., et al. A single-step photolithographic interface for cell-free gene expression and active biochips. Small. 3 (3), 500-510 (2007).
  22. Bracha, D., Karzbrun, E., Daube, S. S., Bar-Ziv, R. H. Emergent properties of dense DNA phases toward artificial biosystems on a surface. Accounts Of Chemical Research. 47 (6), 1912-1921 (2014).
  23. Bracha, D., Bar-Ziv, R. H. Dendritic and nanowire assemblies of condensed DNA polymer brushes. Journal of the American Chemical Society. 136 (13), 4945-4953 (2014).
  24. Daube, S. S., Bracha, D., Buxboim, A., Bar-Ziv, R. H. Compartmentalization by directional gene expression. Proceedings Of The National Academy Of Sciences Of The United States Of America. 107 (7), 2836-2841 (2010).
  25. Karzbrun, E., Tayar, A. M., Noireaux, V., Bar-Ziv, R. H. Programmable on-chip DNA compartments as artificial cells. Science. 345 (6198), 829-832 (2014).
  26. Tayar, A. M., Karzbrun, E., Noireaux, V., Bar-Ziv, R. H. Propagating gene expression fronts in a one-dimensional coupled system of artificial cells. Nature Physics. 11 (12), 1037-1041 (2015).
  27. Pardatscher, G., Schwarz-Schilling, M., Daube, S. S., Bar-Ziv, R. H., Simmel, F. C. Gene Expression on DNA Biochips Patterned with Strand-Displacement Lithography. Angewandte Chemie-International Edition In English. 57 (17), 4783-4786 (2018).
  28. Huang, F., Xu, H., Tan, W., Liang, H. Multicolor and Erasable DNA Photolithography. ACS Nano. 8 (7), 6849-6855 (2014).
  29. Huang, F., Zhou, X., Yao, D., Xiao, S., Liang, H. DNA Polymer Brush Patterning through Photocontrollable Surface-Initiated DNA Hybridization Chain Reaction. Small. 11 (43), 5800-5806 (2015).
  30. McDonald, J. C., et al. Fabrication of microfluidic systems in poly(dimethylsiloxane). Electrophoresis. 21 (1), 27-40 (2000).

Tags

Bioteknik fråga 140 Cell-free genuttryck syntetisk biologi biochips litografi mikrofluidik DNA strand förskjutning
Funktionell yta-immobilisering av gener med utgångsämnet Strand deplacement litografi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pardatscher, G., Schwarz-Schilling,… More

Pardatscher, G., Schwarz-Schilling, M., Sagredo, S., Simmel, F. C. Functional Surface-immobilization of Genes Using Multistep Strand Displacement Lithography. J. Vis. Exp. (140), e58634, doi:10.3791/58634 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter