البنكرياس المشتقة الانسجه المستمدة مصفوفة بيونك للطباعة 3D خلايا البنكرياس لادن الانسجه يبني
Summary
مصفوفة خارج الخلية المكررة (dECM) يمكن ان توفر العظة البيئية الدقيقة مناسبه لتلخيص الوظائف المتاصله في الانسجه المستهدفة في بناء هندسيا. توضح هذه المقالة البروتوكولات الخاصة بالتقطير الوراثي لأنسجه البنكرياس ، وتقييم الحبر الحيوي dECM المشتق من انسجه البنكرياس ، وإنشاء انسجه البنكرياس ثلاثية الابعاد باستخدام تقنيه القرصنة البيولوجية.
Abstract
زرع الجزر البنكرياس هو علاج واعده للمرضي الذين يعانون من النوع 1 مرض السكري يرافقه نقص السكر في الكبد والمضاعفات الثانوية. ومع ذلك ، زرع جزيرة لا يزال لديها العديد من القيود مثل انخفاض القدرة علي البقاء من الجزر المزروعة بسبب الفقراء جزيرة البيئة المحيطة وعدائيه. الاضافه إلى ذلك ، الخلايا المنتجة للانسولين المتمايزة من الخلايا الجذعية مستحث الإنسان لديها قدره محدوده علي إفراز الهرمونات الكافية التي يمكن ان تنظم مستوي الجلوكوز في الدم. ولذلك ، فان تحسين النضج عن طريق الخلايا مع العظة المناسبة البيئية الدقيقة مطلوب بشده. في هذه المقالة ، ونحن توضيح البروتوكولات لاعداد مصفوفة الخلايا السرطانية المشتقة من انسجه البنكرياس (pdECM) بيونك لتوفير البيئة الدقيقة المفيدة التي يمكن ان تزيد من حساسية الجلوكوز من الجزر البنكرياس ، تليها وصف العمليات الخاصة بإنشاء انسجه البنكرياس ثلاثية الابعاد باستخدام تقنيه القرصنة المجهرية المستندة إلى الميكروبثق.
Introduction
في الاونه الاخيره ، يعتبر زرع جزيرة البنكرياس علاجا واعدا للمرضي الذين يعانون من مرض السكري من النوع 1. السلامة النسبية والحد الأدنى من الغزو من الاجراء هي مزايا كبيره لهذا العلاج1. ومع ذلك ، لديها العديد من القيود مثل معدل النجاح المنخفض لعزل الجزر والآثار الجانبية للادويه المثبطة للمناعة. علاوة علي ذلك, ينخفض الرقم من [اينغرتد] جزائر باطراد بعد عمليه زرع واجبه إلى البيئة عدائيه2. وقد تم تطبيق العديد من المواد الحيوية المتوافقة مثل الجينات ، الكولاجين ، بولي (حمض اللاكتيك-شارك-غليكوليك) (PLGA) أو البولي إيثيلين غليكول (PEG) لزرع جزيرة البنكرياس للتغلب علي هذه الصعوبات.
تظهر تقنيه الطباعة الخلوية ثلاثية الابعاد في هندسه الانسجه نظرا لإمكاناتها الكبيرة وأداءها العالي. وغني عن القول ان الأحبار الحيوية معروفه بأنها مكونات هامه لتوفير بيئة دقيقه مناسبه وتمكين تحسين العمليات الخلوية في تراكيب الانسجه المطبوعة. ويستخدم علي نطاق واسع عدد كبير من الهلام المائي ترقق القص مثل الليفينات ، الجينات ، والكولاجين والأحبار الحيوية. ومع ذلك ، تظهر هذه المواد نقص الهيكلية والكيميائية والبيولوجية والميكانيكية التعقيد مقارنه مع مصفوفة خارج الخلية (ECM) في الانسجه الاصليه3. الإشارات البيئية الدقيقة مثل التفاعلات بين الجزر الصغيرة و ECM هي إشارات هامه لتعزيز وظيفة الجزر. يمكن ان يعيد التركيب النوعي النسيجي لمكونات ECM المختلفة ، بما في ذلك الكولاجين ، الغليكوسامينوجليكانز ، والبروتينات السكرية (dECM). علي سبيل المثال ، الجزر الاساسيه التي تحتفظ ECMs الطرفية (علي سبيل المثال ، النوع الأول ، الثالث ، الرابع ، الخامس ، والسادس الكولاجين ، laminin ، وفيبروكتين) تظهر منخفضه المبرمج وحساسية الانسولين أفضل ، مما يدل علي ان التفاعلات خليه مصفوفةالانسجهالخاصة مهمة لتعزيز قدرتها علي العمل
في هذه الورقة ، نقوم بتوضيح البروتوكولات الخاصة باعداد مصفوفة الخلايا السرطانية المشتقة من انسجه البنكرياس (pdECM) لتوفير الإشارات البيئية الدقيقة المفيدة لتعزيز نشاط ووظائف الجزر البنكرياس ، تليها عمليات توليد انسجه البنكرياس ثلاثية الابعاد باستخدام تقنيه القرصنة المجهرية (الشكل 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
وقد وصف هذا البروتوكول تطور الأحبار الحيوية pdECM وتصنيع انسجه البنكرياس ثلاثية الابعاد باستخدام تقنيات الطباعة الخلوية ثلاثية الابعاد. لتلخيص البيئة المجهرية للانسجه المستهدفة في بناء الانسجه المهندسة ثلاثية الابعاد ، يعتبر اختيار الحبر الحيوي أمرا حاسما. في دراسة سابقه ، قمنا بالتحقق م…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد حظي هذا البحث بدعم برنامج تطوير التكنولوجيا الطبية & البيولوجية التابع للمؤسسة الوطنية للبحوث التي تمولها الحكومة الكورية (2017M3A9C6032067) و “برنامج تكنولوجيا المعلومات والاتصال كونسيلينسي الإبداعي” (2019-2011-1-00783 IITP). تشرف عليها الرابطة (معهد المعلومات & تخطيط تكنولوجيا الاتصالات & التقييم).
Materials
| Biological Safety Cabinets | CRYSTE | PURICUBE 1200 | |
| Deep Freezer | Thermo Scientific Forma | 957 | |
| Digital orbital shaker | DAIHAN Scientific | DH.WSO04010 | |
| Dry oven | DAIHAN Scientific | WON-155 | |
| Freeze dryer | LABCONCO | 7670540 | |
| Fridge | SANSUNG | CRFD-1141 | |
| Grater | ABM | 1415605793 | |
| Inverted Microscopes | Leica | DMi1 | |
| Microcentrifuge | CRYSTE | PURISPIN 17R | |
| Microplate reader | Thermo Fisher Scientific | Multiskan GO | |
| Mini centrifuge | DAIHAN Scientific | CF-5 | |
| Multi-Hotplate Stirrers | DAIHAN Scientific | SMHS-6 | |
| Nanodrop | Thermo Fisher Scientific | ND-LITE-PR | |
| pH benchtop meter | Thermo Fisher Scientific | STARA2110 | |
| Rheometer | TA Instrument | Discovery HR-2 | |
| Vortex Mixer | DAIHAN Scientific | VM-10 | |
| Cirurgical Instruments | |||
| Operating Scissors | Hirose | HC.13-122 | |
| Forcep | Korea Ace Scientific | HC.203-30 | |
| Materials | |||
| 1.7 mL microcentrifuge tube | Axygen | MCT-175-C | |
| 10 ml glass vial | Scilab | SL.VI1243 | |
| 40 µm cell strainer | Falcon | 352340 | |
| 5 L beaker | Dong Sung Science | SDS 2400 | |
| 50 mL cornical tube | Falcon | 352070 | |
| 500 mL beaker | Korea Ace Scientific | KA.23-08 | |
| 500 mL bottle-top vacuum filter | Corning | 431118 | |
| 500 mL plastic container | LOCK&LOCK | INL301 | |
| 96well plate | Falcon | 353072 | |
| Aluminum foil | DAEKYO | ||
| Kimwipe | Kimtech | ||
| Magnetic bar | Korea Ace Scientific | BA.37110-0003 | |
| Mortar and pestle | DAIHAN Scientific | SC.MG100 | |
| Multi-channel pipettor | Eppendorf | 4982000314 | |
| Petri Dish | SPL | 10100 | |
| pH indicator strips | Sigma-Aldrich | 1095350001 | |
| Sieve filter mesh | DAIHAN Scientific | ||
| Decellularization | |||
| 10x pbs | Hyclone | SH30258.01 | |
| 4.7% Peracetic acid | Omegafarm | ||
| 70% ethanol | SAMCHUN CHEMICALS | E0220 SAM | |
| Distilled water | |||
| IPA | SAMCHUN CHEMICALS | samchun I0348 | |
| Triton-X 100 | Biosesang | T1020 | |
| Biochemical assay | |||
| 1,9-Dimethyl-Methylene Blue zinc chloride double salt | Sigma-Aldrich | 341088 | |
| 10 N NaOH | Biosesang | S2018 | |
| Chloramine T | Sigma-Aldrich | 857319 | |
| Chondroitin sulfate A | Sigma-Aldrich | C4384 | |
| Citric acid | Supelco | 46933 | |
| Cysteine-HCl | Sigma-Aldrich | C1276 | |
| Glacial acetic acid | Merok | 100063 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | 410225 | |
| HCl | Sigma-Aldrich | H1758 | |
| Na2-EDTA | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| NaCl | SAMCHUN CHEMICALS | S2097 | |
| Papain | Sigma-Aldrich | p4762 | |
| P-DAB | Sigma-Aldrich | D2004 | |
| Perchloric acid | Sigma-Aldrich | 311421 | |
| Sodium acetate | Sigma-Aldrich | S5636 | |
| Sodium hydroxide | Supelco | SX0607N | |
| Sodium phosphate(monobasic) | Sigma-Aldrich | RDD007 | |
| Toluene | Sigma-Aldrich | 244511 | |
| Bioink | |||
| Charicterized FBS | Hyclone | SH30084.03 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Pepsin | Sigma-Aldrich | P7215 | |
| Rose bengal | Sigma-Aldrich | 198250 | |
| RPMI-1640 medium | Thermo Fisher Scientific | 11875093 | |
| Trypan Blue solution | Sigma-Aldrich | T8154 |
References
- Shapiro, A. J., Pokrywczynska, M., Ricordi, C. Clinical pancreatic islet transplantation. Nature Reviews Endocrinology. 13 (5), 268 (2017).
- Venturini, M., et al. Technique, complications, and therapeutic efficacy of percutaneous transplantation of human pancreatic islet cells in type 1 diabetes: the role of US. Radiology. 234 (2), 617-624 (2005).
- Xie, D., et al. Cytoprotection of PEG-modified adult porcine pancreatic islets for improved xenotransplantation. Biomaterials. 26 (4), 403-412 (2005).
- Sackett, S. D., et al. Extracellular matrix scaffold and hydrogel derived from decellularized and delipidized human pancreas. Scientific Reports. 8 (1), 10452 (2018).
- Kim, J., et al. 3D cell printing of islet-laden pancreatic tissue-derived extracellular matrix bioink constructs for enhancing pancreatic functions. Journal of Materials Chemistry B. 7 (10), 1773-1781 (2019).
- Yi, H. G., et al. A bioprinted human-glioblastoma-on-a-chip for the identification of patient-specific responses to chemoradiotherapy. Nature Biomedical Engineering. 1, (2019).
- Das, S., et al. Decellularized extracellular matrix bioinks and the external stimuli to enhance cardiac tissue development in vitro. Acta Biomaterialia. , (2019).
- Kim, H., et al. Shear-induced alignment of collagen fibrils using 3D cell printing for corneal stroma tissue engineering. Biofabrication. 11 (3), 035017 (2019).
- Huang, H. H., Ramachandran, K., Stehno-Bittel, L. A replacement for islet equivalents with improved reliability and validity. Acta Diabetologica. 50 (5), 687-696 (2013).
- Pati, F., et al. Printing three-dimensional tissue analogues with decellularized extracellular matrix bioink. Nature Communications. 5, 3935 (2014).
- Hussey, G. S., Dziki, J. L., Badylak, S. F. Extracellular matrix-based materials for regenerative medicine. Nature Reviews Materials. 1, (2018).
- Kim, B. S., Kim, H., Gao, G., Jang, J., Cho, D. W. Decellularized extracellular matrix: a step towards the next generation source for bioink manufacturing. Biofabrication. 9 (3), 034104 (2017).
- Gaetani, R., et al. Evaluation of different decellularization protocols on the generation of pancreas-derived hydrogels. Tissue Engineering Part C: Methods. 24 (12), 697-708 (2018).
- Gao, G., et al. Tissue engineered bio-blood-vessels constructed using a tissue-specific bioink and 3D coaxial cell printing technique: a novel therapy for ischemic disease. Advanced Functional Materials. 27 (33), 1700798 (2017).
- La, W. G., et al. Systemically replicated organic and inorganic bony microenvironment for new bone formation generated by a 3D printing technology. RSC Advances. 6 (14), 11546-11553 (2016).
- Lee, H., et al. Development of liver decellularized extracellular matrix bioink for three-dimensional cell printing-based liver tissue engineering. Biomacromolecules. 18 (4), 1229-1237 (2017).
- Choudhury, D., Tun, H. W., Wang, T., Naing, M. W. Organ-derived decellularized extracellular matrix: a game changer for bioink manufacturing?. Trends in Biotechnology. 36 (8), 787-805 (2018).
- Kurpios, N. A., et al. The direction of gut looping is established by changes in the extracellular matrix and in cell: cell adhesion. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (25), 8499-8506 (2008).
- Sakai, T., Larsen, M., Yamada, K. M. Fibronectin requirement in branching morphogenesis. Nature. 423 (6942), 876 (2003).
