Pankreasgewebe-abgeleitete extrazelluläre Matrix Bioink für den Druck 3D-Zell-Laden Pankreasgewebe Konstrukte
Summary
Dezelluläre extrazelluläre Matrix (dECM) kann geeignete mikroökologische Hinweise liefern, um die inhärenten Funktionen von Zielgeweben in einem konstruierten Konstrukt zu rekapitulieren. Dieser Artikel erläutert die Protokolle für die Dezellularisierung von Bauchspeicheldrüsengewebe, die Bewertung von DECM-Bioink aus Bauchspeicheldrüsengewebe und die Generierung von 3D-Pankreasgewebekonstrukten mit einer Bioprinting-Technik.
Abstract
Die Transplantation von Pankreasinseln ist eine vielversprechende Behandlung für Patienten, die an Typ-1-Diabetes leiden, begleitet von Hypoglykämie und sekundären Komplikationen. Die Inseltransplantation hat jedoch noch einige Einschränkungen, wie z. B. die geringe Lebensfähigkeit transplantierter Inselchen aufgrund schlechter Inselverordnung und feindlicher Umgebungen. Darüber hinaus haben die Insulin produzierenden Zellen, die sich von menschlichen pluripotenten Stammzellen unterscheiden, nur begrenzte Fähigkeit, ausreichende Hormone zu sezernieren, die den Blutzuckerspiegel regulieren können; Daher ist eine Verbesserung der Reifung durch die Kultivierung von Zellen mit geeigneten mikroökologischen Hinweisen dringend erforderlich. In diesem Artikel erläutern wir Protokolle zur Vorbereitung einer pankreasischen, dezellularisierten extrazellulären Matrix (pdECM)-Bioink, um eine vorteilhafte Mikroumgebung zu schaffen, die die Glukoseempfindlichkeit von Pankreasinseln erhöhen kann, die Prozesse zur Erzeugung von 3D-Pankreasgewebekonstrukten mit einer Mikroextrusions-basierten Bioprinting-Technik.
Introduction
Kürzlich wurde die Pankreas-Islet-Transplantation als vielversprechende Behandlung für Patienten mit Typ-1-Diabetes angesehen. Die relative Sicherheit und minimale Invasivität des Verfahrens sind große Vorteile dieser Behandlung1. Jedoch, Es hat mehrere Einschränkungen wie die geringe Erfolgsrate der isolierenden Inseln und die Nebenwirkungen von immunsuppressiven Medikamenten. Darüber hinaus nimmt die Zahl der eingepfropften Inselchen nach der Transplantation aufgrund der feindlichen Umgebung stetig ab2. Verschiedene biokompatible Materialien wie Alginat, Kollagen, Poly(Milch-Co-Glykolsäure) (PLGA) oder Polyethylenglykol (PEG) wurden bei der Pankreas-Islet-Transplantation angewendet, um diese Schwierigkeiten zu überwinden.
Die 3D-Zelldrucktechnologie entwickelt sich in der Tissue-Engineering aufgrund ihres großen Potenzials und ihrer hohen Leistung. Selbstverständlich sind Bioinks als wichtige Komponenten bekannt, um eine geeignete Mikroumgebung zu schaffen und die Verbesserung zellulärer Prozesse in gedruckten Gewebekonstrukten zu ermöglichen. Eine beträchtliche Anzahl von scherendünnenden Hydrogelen wie Fibrin, Alginat und Kollagen sind weit verbreitet als Bioinks verwendet. Diese Materialien weisen jedoch einen Mangel an struktureller, chemischer, biologischer und mechanischer Komplexität im Vergleich zur extrazellulären Matrix (ECM) im nativen Gewebe3auf. Mikroökologische Hinweise wie die Wechselwirkungen zwischen Inselchen und ECM sind wichtige Signale zur Verbesserung der Funktion von Inselchen. Dezellularisiertes ECM (dECM) kann die gewebespezifische Zusammensetzung verschiedener ECM-Komponenten wie Kollagen, Glycosaminoglycane (GAGs) und Glykoproteine nachbilden. Beispielsweise weisen primäre Inselchen, die ihre peripheren ECMs (z. B. Typ I, III, IV, V und VI Kollagen, Laminin und Fibronectin) behalten, eine geringe Apoptose und eine bessere Insulinempfindlichkeit auf, was darauf hindeutet, dass gewebespezifische Zellmatrix-Wechselwirkungen wichtig sind, um ihre Fähigkeit zu verbessern, ähnlich wie das ursprüngliche Gewebe zu funktionieren4.
In diesem Beitrag erläutern wir Protokolle zur Vorbereitung von Pankreasgewebe-abgeleiteten dezellularisierten extrazellulären Matrix (pdECM) Bioink, um vorteilhafte mikroökologische Hinweise zur Steigerung der Aktivität und Funktionen der Pankreasinseln zu bieten, gefolgt von den Prozessen zur Erzeugung von 3D-Pankreasgewebekonstrukten mit einer mikroextrusionbasierten Bioprinting-Technik (Abbildung 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Protokoll beschrieb die Entwicklung von pdECM-Bioinks und die Herstellung von 3D-Pankreasgewebekonstrukten unter Verwendung von 3D-Zelldrucktechniken. Um die Mikroumgebung des Zielgewebes im 3D-Technischen Gewebekonstrukt zu rekapitulieren, ist die Wahl des Bioinks entscheidend. In einer früheren Studie haben wir validiert, dass gewebespezifische dECM-Bioinks vorteilhaft sind, um die Stammzelldifferenzierung und Proliferation zu fördern10. Im Vergleich zu synthetischen Polymeren kann dECM…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Forschung wurde durch das Bio & Medical Technology Development Program der National Research Foundation (NRF) unterstützt, das von der koreanischen Regierung (MSIT) (2017M3A9C6032067) und dem “ICT Consilience Creative Program” (IITP-2019-2011-1-00783) gefördert wurde. iITP (Institute for Information & Communications Technology Planning & Evaluation).
Materials
| Biological Safety Cabinets | CRYSTE | PURICUBE 1200 | |
| Deep Freezer | Thermo Scientific Forma | 957 | |
| Digital orbital shaker | DAIHAN Scientific | DH.WSO04010 | |
| Dry oven | DAIHAN Scientific | WON-155 | |
| Freeze dryer | LABCONCO | 7670540 | |
| Fridge | SANSUNG | CRFD-1141 | |
| Grater | ABM | 1415605793 | |
| Inverted Microscopes | Leica | DMi1 | |
| Microcentrifuge | CRYSTE | PURISPIN 17R | |
| Microplate reader | Thermo Fisher Scientific | Multiskan GO | |
| Mini centrifuge | DAIHAN Scientific | CF-5 | |
| Multi-Hotplate Stirrers | DAIHAN Scientific | SMHS-6 | |
| Nanodrop | Thermo Fisher Scientific | ND-LITE-PR | |
| pH benchtop meter | Thermo Fisher Scientific | STARA2110 | |
| Rheometer | TA Instrument | Discovery HR-2 | |
| Vortex Mixer | DAIHAN Scientific | VM-10 | |
| Cirurgical Instruments | |||
| Operating Scissors | Hirose | HC.13-122 | |
| Forcep | Korea Ace Scientific | HC.203-30 | |
| Materials | |||
| 1.7 mL microcentrifuge tube | Axygen | MCT-175-C | |
| 10 ml glass vial | Scilab | SL.VI1243 | |
| 40 µm cell strainer | Falcon | 352340 | |
| 5 L beaker | Dong Sung Science | SDS 2400 | |
| 50 mL cornical tube | Falcon | 352070 | |
| 500 mL beaker | Korea Ace Scientific | KA.23-08 | |
| 500 mL bottle-top vacuum filter | Corning | 431118 | |
| 500 mL plastic container | LOCK&LOCK | INL301 | |
| 96well plate | Falcon | 353072 | |
| Aluminum foil | DAEKYO | ||
| Kimwipe | Kimtech | ||
| Magnetic bar | Korea Ace Scientific | BA.37110-0003 | |
| Mortar and pestle | DAIHAN Scientific | SC.MG100 | |
| Multi-channel pipettor | Eppendorf | 4982000314 | |
| Petri Dish | SPL | 10100 | |
| pH indicator strips | Sigma-Aldrich | 1095350001 | |
| Sieve filter mesh | DAIHAN Scientific | ||
| Decellularization | |||
| 10x pbs | Hyclone | SH30258.01 | |
| 4.7% Peracetic acid | Omegafarm | ||
| 70% ethanol | SAMCHUN CHEMICALS | E0220 SAM | |
| Distilled water | |||
| IPA | SAMCHUN CHEMICALS | samchun I0348 | |
| Triton-X 100 | Biosesang | T1020 | |
| Biochemical assay | |||
| 1,9-Dimethyl-Methylene Blue zinc chloride double salt | Sigma-Aldrich | 341088 | |
| 10 N NaOH | Biosesang | S2018 | |
| Chloramine T | Sigma-Aldrich | 857319 | |
| Chondroitin sulfate A | Sigma-Aldrich | C4384 | |
| Citric acid | Supelco | 46933 | |
| Cysteine-HCl | Sigma-Aldrich | C1276 | |
| Glacial acetic acid | Merok | 100063 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | 410225 | |
| HCl | Sigma-Aldrich | H1758 | |
| Na2-EDTA | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| NaCl | SAMCHUN CHEMICALS | S2097 | |
| Papain | Sigma-Aldrich | p4762 | |
| P-DAB | Sigma-Aldrich | D2004 | |
| Perchloric acid | Sigma-Aldrich | 311421 | |
| Sodium acetate | Sigma-Aldrich | S5636 | |
| Sodium hydroxide | Supelco | SX0607N | |
| Sodium phosphate(monobasic) | Sigma-Aldrich | RDD007 | |
| Toluene | Sigma-Aldrich | 244511 | |
| Bioink | |||
| Charicterized FBS | Hyclone | SH30084.03 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Pepsin | Sigma-Aldrich | P7215 | |
| Rose bengal | Sigma-Aldrich | 198250 | |
| RPMI-1640 medium | Thermo Fisher Scientific | 11875093 | |
| Trypan Blue solution | Sigma-Aldrich | T8154 |
References
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