Bioink extracellulaire de matrice de tissu pancréatique-dérivé pour l'impression 3D Cell-Laden Pancréatique Tissue Constructs
Summary
La matrice extracellulaire décellularisée (DECM) peut fournir des indices microenvironnementaux appropriés pour récapituler les fonctions inhérentes des tissus cibles dans une construction machinée. Cet article élucide les protocoles pour la décellularisation du tissu pancréatique, l’évaluation du bioink dECM pancréatique de tissu-dérivé, et la génération des constructions pancréatiques 3D de tissu utilisant une technique de bioimpression.
Abstract
La transplantation d’îlots pancréatiques est un traitement prometteur pour les patients qui souffrent de diabète de type 1 accompagnés d’hypoglycémie et de complications secondaires. Cependant, la transplantation d’îlots a encore plusieurs limitations telles que la faible viabilité des îlots transplantés en raison de l’engraftment pauvre d’îlot et des environnements hostiles. En outre, les cellules productrices d’insuline différenciées des cellules souches pluripotentes humaines ont une capacité limitée de sécrétiser suffisamment d’hormones qui peuvent réguler le niveau de glucose sanguin; par conséquent, l’amélioration de la maturation en cculturant des cellules avec des indices microenvironnementaux appropriés est fortement nécessaire. Dans cet article, nous élucidons des protocoles pour préparer un bioink de matrice extracellulaire décellularized de tissu pancréatique (pdECM) pour fournir un microenvironnement salutaire qui peut augmenter la sensibilité de glucose des îlots pancréatiques, suivi en décrivant les processus pour produire le tissu pancréatique 3D construit utilisant une technique de bioimpression basée sur la microextrusion.
Introduction
Récemment, la transplantation pancréatique d’îlot a été considérée un traitement prometteur pour des patients présentant le diabète de type 1. La sécurité relative et l’invasivité minimale de la procédure sont de grands avantages de ce traitement1. Cependant, il a plusieurs limitations telles que le faible taux de réussite des îlots isolants et les effets secondaires des médicaments immunosuppresseurs. En outre, le nombre d’îlots greffés diminue régulièrement après la transplantation en raison de l’environnement hostile2. Divers matériaux biocompatibles tels que l’alginate, le collagène, le poly (acide co-glycolique lactique) (PLGA) ou le polyéthylène glycol (PEG) ont été appliqués à la transplantation pancréatique d’îlot pour surmonter ces difficultés.
La technologie d’impression de cellules 3D est en train d’émerger dans l’ingénierie tissulaire en raison de son grand potentiel et de ses performances élevées. Inutile de dire que les bioinks sont connus comme des composants importants pour fournir un microenvironnement approprié et permettre l’amélioration des processus cellulaires dans les constructions de tissus imprimés. Un nombre substantiel d’hydrogels de cisaillement tels que la fibrine, l’alginate, et le collagène sont employés couramment comme bioinks. Cependant, ces matériaux montrent un manque de complexité structurale, chimique, biologique et mécanique par rapport à la matrice extracellulaire (ECM) dans le tissu indigène3. Les indices microenvironnementaux tels que les interactions entre les îlots et l’ECM sont des signaux importants pour améliorer la fonction des îlots. L’ECM décellularisé (DECM) peut recréer la composition tissulaire spécifique de divers composants d’ECM comprenant le collagène, les glycosaminoglycans (GAGs), et les glycoprotéines. Par exemple, les îlots primaires qui conservent leurs ECM périphériques (p. ex., type I, III, collagène IV, V et VI, lamininin et fibronectin) présentent une faible apoptose et une meilleure sensibilité à l’insuline, ce qui indique que les interactions cellulaires-matricespécifiques spécifiques aux tissus sont importantes pour améliorer leur capacité à fonctionner de la même façon que le tissu original4.
Dans cet article, nous élucidons des protocoles pour la préparation du bioink de matrice extracellulaire décellularisé dérivé du tissu pancréatique (pdECM) pour fournir des indices microenvironnementaux bénéfiques pour stimuler l’activité et les fonctions des îlots pancréatiques, suivis par les processus pour générer des constructions de tissu pancréatique 3D utilisant une technique de bioimpression à base de microextrusion (Figure 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
Ce protocole a décrit le développement des bioinks de pdECM et la fabrication des constructions pancréatiques 3D de tissu en utilisant des techniques d’impression de cellules 3D. Pour récapituler le microenvironnement du tissu cible dans la construction de tissu machiné 3D, le choix du bioink est critique. Dans une étude précédente, nous avons validé que les bioinks dECM spécifiques aux tissus sont bénéfiques pour favoriser la différenciation et la prolifération des cellules souches10</sup…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette recherche a été appuyée par le programme de développement des technologies bio et médicales de la National Research Foundation (NRF) financé par le gouvernement coréen (MSIT) (2017M3A9C6032067) et le « ICT Consilience Creative Program » (IITP-2019-2011-1-00783) supervisé par l’IITP (Institute for Information and Communications Technology Planning and Evaluation).
Materials
| Biological Safety Cabinets | CRYSTE | PURICUBE 1200 | |
| Deep Freezer | Thermo Scientific Forma | 957 | |
| Digital orbital shaker | DAIHAN Scientific | DH.WSO04010 | |
| Dry oven | DAIHAN Scientific | WON-155 | |
| Freeze dryer | LABCONCO | 7670540 | |
| Fridge | SANSUNG | CRFD-1141 | |
| Grater | ABM | 1415605793 | |
| Inverted Microscopes | Leica | DMi1 | |
| Microcentrifuge | CRYSTE | PURISPIN 17R | |
| Microplate reader | Thermo Fisher Scientific | Multiskan GO | |
| Mini centrifuge | DAIHAN Scientific | CF-5 | |
| Multi-Hotplate Stirrers | DAIHAN Scientific | SMHS-6 | |
| Nanodrop | Thermo Fisher Scientific | ND-LITE-PR | |
| pH benchtop meter | Thermo Fisher Scientific | STARA2110 | |
| Rheometer | TA Instrument | Discovery HR-2 | |
| Vortex Mixer | DAIHAN Scientific | VM-10 | |
| Cirurgical Instruments | |||
| Operating Scissors | Hirose | HC.13-122 | |
| Forcep | Korea Ace Scientific | HC.203-30 | |
| Materials | |||
| 1.7 mL microcentrifuge tube | Axygen | MCT-175-C | |
| 10 ml glass vial | Scilab | SL.VI1243 | |
| 40 µm cell strainer | Falcon | 352340 | |
| 5 L beaker | Dong Sung Science | SDS 2400 | |
| 50 mL cornical tube | Falcon | 352070 | |
| 500 mL beaker | Korea Ace Scientific | KA.23-08 | |
| 500 mL bottle-top vacuum filter | Corning | 431118 | |
| 500 mL plastic container | LOCK&LOCK | INL301 | |
| 96well plate | Falcon | 353072 | |
| Aluminum foil | DAEKYO | ||
| Kimwipe | Kimtech | ||
| Magnetic bar | Korea Ace Scientific | BA.37110-0003 | |
| Mortar and pestle | DAIHAN Scientific | SC.MG100 | |
| Multi-channel pipettor | Eppendorf | 4982000314 | |
| Petri Dish | SPL | 10100 | |
| pH indicator strips | Sigma-Aldrich | 1095350001 | |
| Sieve filter mesh | DAIHAN Scientific | ||
| Decellularization | |||
| 10x pbs | Hyclone | SH30258.01 | |
| 4.7% Peracetic acid | Omegafarm | ||
| 70% ethanol | SAMCHUN CHEMICALS | E0220 SAM | |
| Distilled water | |||
| IPA | SAMCHUN CHEMICALS | samchun I0348 | |
| Triton-X 100 | Biosesang | T1020 | |
| Biochemical assay | |||
| 1,9-Dimethyl-Methylene Blue zinc chloride double salt | Sigma-Aldrich | 341088 | |
| 10 N NaOH | Biosesang | S2018 | |
| Chloramine T | Sigma-Aldrich | 857319 | |
| Chondroitin sulfate A | Sigma-Aldrich | C4384 | |
| Citric acid | Supelco | 46933 | |
| Cysteine-HCl | Sigma-Aldrich | C1276 | |
| Glacial acetic acid | Merok | 100063 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | 410225 | |
| HCl | Sigma-Aldrich | H1758 | |
| Na2-EDTA | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| NaCl | SAMCHUN CHEMICALS | S2097 | |
| Papain | Sigma-Aldrich | p4762 | |
| P-DAB | Sigma-Aldrich | D2004 | |
| Perchloric acid | Sigma-Aldrich | 311421 | |
| Sodium acetate | Sigma-Aldrich | S5636 | |
| Sodium hydroxide | Supelco | SX0607N | |
| Sodium phosphate(monobasic) | Sigma-Aldrich | RDD007 | |
| Toluene | Sigma-Aldrich | 244511 | |
| Bioink | |||
| Charicterized FBS | Hyclone | SH30084.03 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Pepsin | Sigma-Aldrich | P7215 | |
| Rose bengal | Sigma-Aldrich | 198250 | |
| RPMI-1640 medium | Thermo Fisher Scientific | 11875093 | |
| Trypan Blue solution | Sigma-Aldrich | T8154 |
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