3D細胞-細胞-膵組織コンストラクトを印刷するための膵組織由来細胞外マトリックスバイオインク
Summary
脱細胞細胞細胞細胞外マトリックス(dECM)は、工学的構造における標的組織の固有の機能を再現するための適切なマイクロ環境手掛かりを提供することができる。本稿では、膵組織の脱細胞化、膵臓組織由来dECMバイオインクの評価、バイオプリンティング技術を用いた3D膵臓組織構築物の生成に関するプロトコルを解明する。
Abstract
膵島の移植は、低血糖および二次合併症を伴う1型糖尿病に罹患した患者のための有望な治療法である。しかしながら、島の移植はまだ貧しい島の生着や敵対的な環境による移植された島の生存率の低さのようないくつかの制限を持っています。さらに、ヒト多能性幹細胞から分化したインスリン産生細胞は、血糖値を調節できる十分なホルモンを分泌する能力が限られている。そのため、適切なマイクロ環境的手掛かりを持つ細胞を培養して成熟を改善することは強く求められている。本稿では、膵島のグルコース感受性を高めることができる有益な微小環境を提供するために、膵組織由来の細胞外細胞外細胞外マトリックス(pdECM)バイオインクを調製するためのプロトコルを解明し、マイクロ押出ベースのバイオプリンティング技術を用いて3D膵臓組織構築物を生成するプロセス。
Introduction
近年、膵島移植は1型糖尿病患者に対する有望な治療法と考えられている。手順の相対的な安全性および最低の侵襲性は、この処置1の大きな利点である。しかし、島の孤立の成功率が低い、免疫抑制薬の副作用など、いくつかの制限があります。さらに、生着島の数は、敵対的な環境2に起因する移植後に着実に減少する。これらの困難を克服するために、アルギン酸塩、コラーゲン、ポリ(乳酸共グリコール酸)(PLGA)またはポリエチレングリコール(PEG)などの種々の生体適合性物質が膵島移植に適用されています。
3D細胞印刷技術は、その大きな可能性と高性能のために組織工学で出現しています。言うまでもなく、バイオインクは、適切な微小環境を提供し、印刷された組織構造における細胞プロセスの改善を可能にするための重要なコンポーネントとして知られています。フィブリン、アルギン酸塩、コラーゲンなどのせん断薄ヒドロゲルの相当数は、バイオインクスとして広く使用されています。しかしながら、これらの物質は、天然組織3における細胞外マトリックス(ECM)と比較して構造的、化学的、生物学的、および機械的複雑性の欠如を示す。小島とECMの相互作用などの微小環境上の手掛かりは、島の機能を高めるための重要なシグナルです。脱細胞化ECM(dECM)は、コラーゲン、グリコサミノグリカン(GAG)、および糖タンパク質を含む様々なECM成分の組織特異的組成物を再現することができる。例えば、末梢ECMを保持する一次島(例えば、I型、III型、IV型、Iv、VIコラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン)は、低アポトーシスおよびより良いインスリン感受性を示し、したがって、組織特異的細胞マトリックス相互作用が元の組織4と同様に機能する能力を高めるために重要であることを示す。
本論文では、膵組織由来の細胞外細胞外マトリックス(pdECM)バイオインクを調製し、膵島の活性と機能を高めるための有益な微小環境的手掛かりを提供するためのプロトコルを解明し、続いてマイクロエクストルションベースのバイオプリンティング技術を用いて3D膵組織構築物を生成するプロセスを解明する(図1)。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルは、pdECMバイオインクの開発と3D細胞印刷技術を用いた3D膵臓組織構築物の製造について説明した。3D工学組織構築物中の標的組織の微小環境を再現するには、バイオインクの選択が重要である。以前の研究では、組織特異的dECMバイオインクが幹細胞分化および増殖10を促進するのに有益であることを検証した。合成ポリマーと比較して、dECMは、組織特異的な?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、韓国政府(MSIT)が出資する国立研究財団(NRF)の生物・医療技術開発プログラム(2017M3A9C6032067)と「ICTコンシレンス・クリエイティブ・プログラム」(IITP-2019-2011-1-00783)によって支援されました。IITP(情報通信技術企画評価研究所)が監修。
Materials
| Biological Safety Cabinets | CRYSTE | PURICUBE 1200 | |
| Deep Freezer | Thermo Scientific Forma | 957 | |
| Digital orbital shaker | DAIHAN Scientific | DH.WSO04010 | |
| Dry oven | DAIHAN Scientific | WON-155 | |
| Freeze dryer | LABCONCO | 7670540 | |
| Fridge | SANSUNG | CRFD-1141 | |
| Grater | ABM | 1415605793 | |
| Inverted Microscopes | Leica | DMi1 | |
| Microcentrifuge | CRYSTE | PURISPIN 17R | |
| Microplate reader | Thermo Fisher Scientific | Multiskan GO | |
| Mini centrifuge | DAIHAN Scientific | CF-5 | |
| Multi-Hotplate Stirrers | DAIHAN Scientific | SMHS-6 | |
| Nanodrop | Thermo Fisher Scientific | ND-LITE-PR | |
| pH benchtop meter | Thermo Fisher Scientific | STARA2110 | |
| Rheometer | TA Instrument | Discovery HR-2 | |
| Vortex Mixer | DAIHAN Scientific | VM-10 | |
| Cirurgical Instruments | |||
| Operating Scissors | Hirose | HC.13-122 | |
| Forcep | Korea Ace Scientific | HC.203-30 | |
| Materials | |||
| 1.7 mL microcentrifuge tube | Axygen | MCT-175-C | |
| 10 ml glass vial | Scilab | SL.VI1243 | |
| 40 µm cell strainer | Falcon | 352340 | |
| 5 L beaker | Dong Sung Science | SDS 2400 | |
| 50 mL cornical tube | Falcon | 352070 | |
| 500 mL beaker | Korea Ace Scientific | KA.23-08 | |
| 500 mL bottle-top vacuum filter | Corning | 431118 | |
| 500 mL plastic container | LOCK&LOCK | INL301 | |
| 96well plate | Falcon | 353072 | |
| Aluminum foil | DAEKYO | ||
| Kimwipe | Kimtech | ||
| Magnetic bar | Korea Ace Scientific | BA.37110-0003 | |
| Mortar and pestle | DAIHAN Scientific | SC.MG100 | |
| Multi-channel pipettor | Eppendorf | 4982000314 | |
| Petri Dish | SPL | 10100 | |
| pH indicator strips | Sigma-Aldrich | 1095350001 | |
| Sieve filter mesh | DAIHAN Scientific | ||
| Decellularization | |||
| 10x pbs | Hyclone | SH30258.01 | |
| 4.7% Peracetic acid | Omegafarm | ||
| 70% ethanol | SAMCHUN CHEMICALS | E0220 SAM | |
| Distilled water | |||
| IPA | SAMCHUN CHEMICALS | samchun I0348 | |
| Triton-X 100 | Biosesang | T1020 | |
| Biochemical assay | |||
| 1,9-Dimethyl-Methylene Blue zinc chloride double salt | Sigma-Aldrich | 341088 | |
| 10 N NaOH | Biosesang | S2018 | |
| Chloramine T | Sigma-Aldrich | 857319 | |
| Chondroitin sulfate A | Sigma-Aldrich | C4384 | |
| Citric acid | Supelco | 46933 | |
| Cysteine-HCl | Sigma-Aldrich | C1276 | |
| Glacial acetic acid | Merok | 100063 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | 410225 | |
| HCl | Sigma-Aldrich | H1758 | |
| Na2-EDTA | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| NaCl | SAMCHUN CHEMICALS | S2097 | |
| Papain | Sigma-Aldrich | p4762 | |
| P-DAB | Sigma-Aldrich | D2004 | |
| Perchloric acid | Sigma-Aldrich | 311421 | |
| Sodium acetate | Sigma-Aldrich | S5636 | |
| Sodium hydroxide | Supelco | SX0607N | |
| Sodium phosphate(monobasic) | Sigma-Aldrich | RDD007 | |
| Toluene | Sigma-Aldrich | 244511 | |
| Bioink | |||
| Charicterized FBS | Hyclone | SH30084.03 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Pepsin | Sigma-Aldrich | P7215 | |
| Rose bengal | Sigma-Aldrich | 198250 | |
| RPMI-1640 medium | Thermo Fisher Scientific | 11875093 | |
| Trypan Blue solution | Sigma-Aldrich | T8154 |
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