인쇄 3D 세포 -라덴 췌장 조직 구성을 인쇄를위한 췌장 조직 유래 세포 외 매트릭스 바이오 잉크
Summary
세포외 세포외 매트릭스(dECM)는 엔지니어링된 구조에서 표적 조직의 고유 기능을 재량화하기 위한 적절한 미세 환경 단서를 제공할 수 있습니다. 이 기사는 췌장 조직의 탈세포화, 췌장 조직 유래 dECM 바이오 잉크의 평가 및 생체 인쇄 기술을 사용하여 3D 췌장 조직 구성의 생성을위한 프로토콜을 설명합니다.
Abstract
췌도의 이식은 저혈당증 및 이차 합병증을 동반한 타입-1 당뇨병 때문에 손해를 입는 환자를 위한 유망한 처리입니다. 그러나, 섬 이식은 여전히 가난한 섬 생착 및 적대적인 환경으로 인해 이식 된 작은 섬의 낮은 생존가능성과 같은 몇 가지 제한사항이 있습니다. 또한, 인간 만능 줄기세포로부터 분화된 인슐린 생성 세포는 혈당 수준을 조절할 수 있는 충분한 호르몬을 분비하는 능력이 제한되어 있다; 따라서 적절한 미세 환경 단서로 세포를 배양하여 성숙을 개선하는 것이 매우 필요합니다. 이 기사에서는 췌도의 포도당 민감도를 증가시킬 수있는 유익한 미세 환경을 제공하기 위해 췌장 조직 유래 탈세포화 세포 질매트릭스 (pdECM) bioink를 준비하기위한 프로토콜을 설명하고 설명합니다. 3D 췌장 조직 생성 과정은 마이크로 압출 기반의 바이오 프린팅 기술을 사용하여 구성됩니다.
Introduction
최근 췌도 이식은 제1형 당뇨병 환자에게 유망한 치료법으로 여겨지고 있다. 절차의 상대적 안전성과 최소 침습성은이 치료의 큰장점입니다 1. 그러나, 그것은 고립 된 섬과 면역 억제 약물의 부작용의 낮은 성공률과 같은 몇 가지 한계가 있다. 더욱이, 적대적인 환경으로 인해 이식 후 이식 후 이식된 작은 섬의 수는 꾸준히 감소한다2. 이러한 어려움을 극복하기 위해 알긴산, 콜라겐, 폴리(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 같은 다양한 생체 적합성 물질이 췌도 이식에 적용되어 왔다.
3D 세포 프린팅 기술은 큰 잠재력과 높은 성능으로 인해 조직 공학에서 부상하고 있습니다. 말할 필요도 없이, bioinks는 인쇄된 조직 구조물에 있는 세포 프로세스의 개선을 가능하게 하는 적당한 미세 환경을 제공하고 가능하게 하기 위한 중요한 분대로 알려져 있습니다. 피브린, 알긴산 및 콜라겐과 같은 전단 숱이 많은 하이드로겔은 바이오잉크로 널리 사용됩니다. 그러나, 이들 물질은 네이티브 조직에서 세포외 매트릭스(ECM)에 비해 구조적, 화학적, 생물학적, 및 기계적 복잡성의 부족을 보여준다3. 섬과 ECM 사이의 상호 작용과 같은 미세 환경 큐는 섬의 기능을 향상시키기위한 중요한 신호입니다. 탈세포화된 ECM(dECM)은 콜라겐, 글리코사미노글리칸(GAGs) 및 당단백질을 포함한 다양한 ECM 성분의 조직 특이적 조성물을 재현할 수 있다. 예를 들어, 그들의 말초 적혈구(예를 들어, 타입 I, III, IV, V, 및 VI 콜라겐, 라미닌 및 섬유넥틴)를 유지하는 원발성 섬은 낮은 세포자멸 및 더 나은 인슐린 감수성을 나타내며, 따라서 조직 특이적 세포-매트릭스 상호작용이 원래 조직과 유사하게 기능하는 능력을 향상시키는 데 중요하다는 것을 나타낸다4.
이 논문에서, 우리는 췌장 췌도의 활동 과 기능을 증폭하기위한 유익한 미세 환경 단서를 제공하기 위해 췌장 조직 유래 탈세포 질성 세포 간 매트릭스 (pdECM) bioink를 준비하기위한 프로토콜을 해명하고, 마이크로 압출 기반의 생체 인쇄 기술을 사용하여 3D 췌장 조직 구조를 생성하는 과정을 수행합니다(그림 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜은 pdECM 바이오 잉크의 개발및 3D 세포 인쇄 기술을 사용하여 3D 췌장 조직 구성의 제조를 설명했다. 3D 엔지니어링 조직 구성에서 표적 조직의 미세 환경을 재환기시키기 위해 bioink의 선택은 매우 중요합니다. 이전 연구에서, 우리는 조직 특이적 dECM 바이오잉크가 줄기세포 분화 및 증식을 촉진하는 데 유익하다는 것을검증했다 10. 합성 중합체에 비해, dECM은 조직 특이?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 한국 정부(MSIT)(2017M3A9C6032067)와 “ICT 융합 창의프로그램”(IITP-2019-2011-1-00783)의 지원을 받아 국립연구재단(NRF)의 바이오 및 의료기술 개발 프로그램을 지원받았습니다. IITP(정보통신기술기획평가연구원)의 감독을 받고 있습니다.
Materials
| Biological Safety Cabinets | CRYSTE | PURICUBE 1200 | |
| Deep Freezer | Thermo Scientific Forma | 957 | |
| Digital orbital shaker | DAIHAN Scientific | DH.WSO04010 | |
| Dry oven | DAIHAN Scientific | WON-155 | |
| Freeze dryer | LABCONCO | 7670540 | |
| Fridge | SANSUNG | CRFD-1141 | |
| Grater | ABM | 1415605793 | |
| Inverted Microscopes | Leica | DMi1 | |
| Microcentrifuge | CRYSTE | PURISPIN 17R | |
| Microplate reader | Thermo Fisher Scientific | Multiskan GO | |
| Mini centrifuge | DAIHAN Scientific | CF-5 | |
| Multi-Hotplate Stirrers | DAIHAN Scientific | SMHS-6 | |
| Nanodrop | Thermo Fisher Scientific | ND-LITE-PR | |
| pH benchtop meter | Thermo Fisher Scientific | STARA2110 | |
| Rheometer | TA Instrument | Discovery HR-2 | |
| Vortex Mixer | DAIHAN Scientific | VM-10 | |
| Cirurgical Instruments | |||
| Operating Scissors | Hirose | HC.13-122 | |
| Forcep | Korea Ace Scientific | HC.203-30 | |
| Materials | |||
| 1.7 mL microcentrifuge tube | Axygen | MCT-175-C | |
| 10 ml glass vial | Scilab | SL.VI1243 | |
| 40 µm cell strainer | Falcon | 352340 | |
| 5 L beaker | Dong Sung Science | SDS 2400 | |
| 50 mL cornical tube | Falcon | 352070 | |
| 500 mL beaker | Korea Ace Scientific | KA.23-08 | |
| 500 mL bottle-top vacuum filter | Corning | 431118 | |
| 500 mL plastic container | LOCK&LOCK | INL301 | |
| 96well plate | Falcon | 353072 | |
| Aluminum foil | DAEKYO | ||
| Kimwipe | Kimtech | ||
| Magnetic bar | Korea Ace Scientific | BA.37110-0003 | |
| Mortar and pestle | DAIHAN Scientific | SC.MG100 | |
| Multi-channel pipettor | Eppendorf | 4982000314 | |
| Petri Dish | SPL | 10100 | |
| pH indicator strips | Sigma-Aldrich | 1095350001 | |
| Sieve filter mesh | DAIHAN Scientific | ||
| Decellularization | |||
| 10x pbs | Hyclone | SH30258.01 | |
| 4.7% Peracetic acid | Omegafarm | ||
| 70% ethanol | SAMCHUN CHEMICALS | E0220 SAM | |
| Distilled water | |||
| IPA | SAMCHUN CHEMICALS | samchun I0348 | |
| Triton-X 100 | Biosesang | T1020 | |
| Biochemical assay | |||
| 1,9-Dimethyl-Methylene Blue zinc chloride double salt | Sigma-Aldrich | 341088 | |
| 10 N NaOH | Biosesang | S2018 | |
| Chloramine T | Sigma-Aldrich | 857319 | |
| Chondroitin sulfate A | Sigma-Aldrich | C4384 | |
| Citric acid | Supelco | 46933 | |
| Cysteine-HCl | Sigma-Aldrich | C1276 | |
| Glacial acetic acid | Merok | 100063 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | 410225 | |
| HCl | Sigma-Aldrich | H1758 | |
| Na2-EDTA | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| NaCl | SAMCHUN CHEMICALS | S2097 | |
| Papain | Sigma-Aldrich | p4762 | |
| P-DAB | Sigma-Aldrich | D2004 | |
| Perchloric acid | Sigma-Aldrich | 311421 | |
| Sodium acetate | Sigma-Aldrich | S5636 | |
| Sodium hydroxide | Supelco | SX0607N | |
| Sodium phosphate(monobasic) | Sigma-Aldrich | RDD007 | |
| Toluene | Sigma-Aldrich | 244511 | |
| Bioink | |||
| Charicterized FBS | Hyclone | SH30084.03 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Pepsin | Sigma-Aldrich | P7215 | |
| Rose bengal | Sigma-Aldrich | 198250 | |
| RPMI-1640 medium | Thermo Fisher Scientific | 11875093 | |
| Trypan Blue solution | Sigma-Aldrich | T8154 |
References
- Shapiro, A. J., Pokrywczynska, M., Ricordi, C. Clinical pancreatic islet transplantation. Nature Reviews Endocrinology. 13 (5), 268 (2017).
- Venturini, M., et al. Technique, complications, and therapeutic efficacy of percutaneous transplantation of human pancreatic islet cells in type 1 diabetes: the role of US. Radiology. 234 (2), 617-624 (2005).
- Xie, D., et al. Cytoprotection of PEG-modified adult porcine pancreatic islets for improved xenotransplantation. Biomaterials. 26 (4), 403-412 (2005).
- Sackett, S. D., et al. Extracellular matrix scaffold and hydrogel derived from decellularized and delipidized human pancreas. Scientific Reports. 8 (1), 10452 (2018).
- Kim, J., et al. 3D cell printing of islet-laden pancreatic tissue-derived extracellular matrix bioink constructs for enhancing pancreatic functions. Journal of Materials Chemistry B. 7 (10), 1773-1781 (2019).
- Yi, H. G., et al. A bioprinted human-glioblastoma-on-a-chip for the identification of patient-specific responses to chemoradiotherapy. Nature Biomedical Engineering. 1, (2019).
- Das, S., et al. Decellularized extracellular matrix bioinks and the external stimuli to enhance cardiac tissue development in vitro. Acta Biomaterialia. , (2019).
- Kim, H., et al. Shear-induced alignment of collagen fibrils using 3D cell printing for corneal stroma tissue engineering. Biofabrication. 11 (3), 035017 (2019).
- Huang, H. H., Ramachandran, K., Stehno-Bittel, L. A replacement for islet equivalents with improved reliability and validity. Acta Diabetologica. 50 (5), 687-696 (2013).
- Pati, F., et al. Printing three-dimensional tissue analogues with decellularized extracellular matrix bioink. Nature Communications. 5, 3935 (2014).
- Hussey, G. S., Dziki, J. L., Badylak, S. F. Extracellular matrix-based materials for regenerative medicine. Nature Reviews Materials. 1, (2018).
- Kim, B. S., Kim, H., Gao, G., Jang, J., Cho, D. W. Decellularized extracellular matrix: a step towards the next generation source for bioink manufacturing. Biofabrication. 9 (3), 034104 (2017).
- Gaetani, R., et al. Evaluation of different decellularization protocols on the generation of pancreas-derived hydrogels. Tissue Engineering Part C: Methods. 24 (12), 697-708 (2018).
- Gao, G., et al. Tissue engineered bio-blood-vessels constructed using a tissue-specific bioink and 3D coaxial cell printing technique: a novel therapy for ischemic disease. Advanced Functional Materials. 27 (33), 1700798 (2017).
- La, W. G., et al. Systemically replicated organic and inorganic bony microenvironment for new bone formation generated by a 3D printing technology. RSC Advances. 6 (14), 11546-11553 (2016).
- Lee, H., et al. Development of liver decellularized extracellular matrix bioink for three-dimensional cell printing-based liver tissue engineering. Biomacromolecules. 18 (4), 1229-1237 (2017).
- Choudhury, D., Tun, H. W., Wang, T., Naing, M. W. Organ-derived decellularized extracellular matrix: a game changer for bioink manufacturing?. Trends in Biotechnology. 36 (8), 787-805 (2018).
- Kurpios, N. A., et al. The direction of gut looping is established by changes in the extracellular matrix and in cell: cell adhesion. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (25), 8499-8506 (2008).
- Sakai, T., Larsen, M., Yamada, K. M. Fibronectin requirement in branching morphogenesis. Nature. 423 (6942), 876 (2003).
