Bioink de matriz extracelular derivada del tejido pancreático para imprimir construcciones de tejido pancreático laden de células 3D
Summary
La matriz extracelular descelularizada (dECM) puede proporcionar señales microambientales adecuadas para recapitular las funciones inherentes de los tejidos diana en una construcción diseñada. Este artículo aclara los protocolos para la descelularización del tejido pancreático, la evaluación del bioink dECM derivado del tejido pancreático y la generación de construcciones de tejido pancreático 3D utilizando una técnica de bioimpresión.
Abstract
El trasplante de islotes pancreáticos es un tratamiento prometedor para los pacientes que sufren de diabetes tipo 1 acompañado de hipoglucemia y complicaciones secundarias. Sin embargo, el trasplante de islotes todavía tiene varias limitaciones, como la baja viabilidad de los islotes trasplantados debido a la falta de injerto de islotes y entornos hostiles. Además, las células productoras de insulina diferenciadas de las células madre pluripotentes humanas tienen una capacidad limitada para secretar suficientes hormonas que pueden regular el nivel de glucosa en sangre; por lo tanto, se requiere encarecidamente mejorar la maduración mediante el cultivo de células con señales microambientales adecuadas. En este artículo, esclarecemos los protocolos para preparar un biocontenido de matriz extracelular descelularizada derivada del tejido pancreático (pdECM) para proporcionar un microambiente beneficioso que puede aumentar la sensibilidad a la glucosa de los islotes pancreáticos, seguido de describir los procesos para generar construcciones de tejido pancreático 3D utilizando una técnica de bioimpresión basada en microextrusión.
Introduction
Recientemente, el trasplante de islotes pancreáticos se ha considerado un tratamiento prometedor para pacientes con diabetes tipo 1. La relativa seguridad y mínima invasividad del procedimiento son grandes ventajas de este tratamiento1. Sin embargo, tiene varias limitaciones como la baja tasa de éxito de islotes de aislación y los efectos secundarios de los fármacos inmunosupresores. Además, el número de islotes injertados disminuye constantemente después del trasplante debido al ambiente hostil2. Se han aplicado varios materiales biocompatibles como alginato, colágeno, ácido poli(láctico-coglicólico) (PLGA) o polietilenglicol (PEG) al trasplante de islotes pancreáticos para superar estas dificultades.
La tecnología de impresión de células 3D está surgiendo en la ingeniería de tejidos debido a su gran potencial y alto rendimiento. No hace falta decir que los bioinks son conocidos como componentes importantes para proporcionar un microambiente adecuado y permitir la mejora de los procesos celulares en construcciones de tejido impreso. Un número sustancial de hidrogeles adelgazamiento de cizallamiento como la fibrina, el alginato y el colágeno se utilizan ampliamente como biotintas. Sin embargo, estos materiales muestran una falta de complejidad estructural, química, biológica y mecánica en comparación con la matriz extracelular (ECM) en el tejido nativo3. Las señales microambientales, como las interacciones entre los islotes y la ECM, son señales importantes para mejorar la función de los islotes. ECM descelularizado (dECM) puede recrear la composición específica del tejido de varios componentes de ECM, incluyendo colágeno, glicosaminoglicanos (GAGs), y glicoproteínas. Por ejemplo, los islotes primarios que conservan sus ECM periféricos (por ejemplo, colágeno, laminina y fibronectina de tipo I, III, IV, V y VI) presentan una baja apoptosis y una mejor sensibilidad a la insulina, lo que indica que las interacciones entre las células y matrices específicas del tejido son importantes para mejorar su capacidad de funcionar de manera similar al tejido original4.
En este artículo, aclaramos protocolos para preparar biotinta de matriz extracelular descelularizada derivada del tejido pancreático (pdECM) para proporcionar señales microambientales beneficiosas para aumentar la actividad y las funciones de los islotes pancreáticos, seguidos de los procesos para generar construcciones de tejido pancreático 3D utilizando una técnica de bioimpresión basada en microextrusión(Figura 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo describió el desarrollo de biotintas pdECM y la fabricación de construcciones de tejido pancreático 3D mediante el uso de técnicas de impresión de células 3D. Para recapitular el microambiente del tejido diana en la construcción de tejido diseñado 3D, la elección de biotinta es fundamental. En un estudio anterior, validamos que las biotintas dECM específicas del tejido son beneficiosas para promover la diferenciación de células madre y la proliferación10. En comparació…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta investigación fue apoyada por el programa bio y tecnología médica de la Fundación Nacional de Investigación (NRF) financiado por el gobierno coreano (MSIT) (2017M3A9C6032067) y “ICT Consilience Creative Program” (IITP-2019-2011-1-00783) supervisado por el IITP (Instituto de Planificación y Evaluación de Tecnologías de la Información y las Comunicaciones).
Materials
| Biological Safety Cabinets | CRYSTE | PURICUBE 1200 | |
| Deep Freezer | Thermo Scientific Forma | 957 | |
| Digital orbital shaker | DAIHAN Scientific | DH.WSO04010 | |
| Dry oven | DAIHAN Scientific | WON-155 | |
| Freeze dryer | LABCONCO | 7670540 | |
| Fridge | SANSUNG | CRFD-1141 | |
| Grater | ABM | 1415605793 | |
| Inverted Microscopes | Leica | DMi1 | |
| Microcentrifuge | CRYSTE | PURISPIN 17R | |
| Microplate reader | Thermo Fisher Scientific | Multiskan GO | |
| Mini centrifuge | DAIHAN Scientific | CF-5 | |
| Multi-Hotplate Stirrers | DAIHAN Scientific | SMHS-6 | |
| Nanodrop | Thermo Fisher Scientific | ND-LITE-PR | |
| pH benchtop meter | Thermo Fisher Scientific | STARA2110 | |
| Rheometer | TA Instrument | Discovery HR-2 | |
| Vortex Mixer | DAIHAN Scientific | VM-10 | |
| Cirurgical Instruments | |||
| Operating Scissors | Hirose | HC.13-122 | |
| Forcep | Korea Ace Scientific | HC.203-30 | |
| Materials | |||
| 1.7 mL microcentrifuge tube | Axygen | MCT-175-C | |
| 10 ml glass vial | Scilab | SL.VI1243 | |
| 40 µm cell strainer | Falcon | 352340 | |
| 5 L beaker | Dong Sung Science | SDS 2400 | |
| 50 mL cornical tube | Falcon | 352070 | |
| 500 mL beaker | Korea Ace Scientific | KA.23-08 | |
| 500 mL bottle-top vacuum filter | Corning | 431118 | |
| 500 mL plastic container | LOCK&LOCK | INL301 | |
| 96well plate | Falcon | 353072 | |
| Aluminum foil | DAEKYO | ||
| Kimwipe | Kimtech | ||
| Magnetic bar | Korea Ace Scientific | BA.37110-0003 | |
| Mortar and pestle | DAIHAN Scientific | SC.MG100 | |
| Multi-channel pipettor | Eppendorf | 4982000314 | |
| Petri Dish | SPL | 10100 | |
| pH indicator strips | Sigma-Aldrich | 1095350001 | |
| Sieve filter mesh | DAIHAN Scientific | ||
| Decellularization | |||
| 10x pbs | Hyclone | SH30258.01 | |
| 4.7% Peracetic acid | Omegafarm | ||
| 70% ethanol | SAMCHUN CHEMICALS | E0220 SAM | |
| Distilled water | |||
| IPA | SAMCHUN CHEMICALS | samchun I0348 | |
| Triton-X 100 | Biosesang | T1020 | |
| Biochemical assay | |||
| 1,9-Dimethyl-Methylene Blue zinc chloride double salt | Sigma-Aldrich | 341088 | |
| 10 N NaOH | Biosesang | S2018 | |
| Chloramine T | Sigma-Aldrich | 857319 | |
| Chondroitin sulfate A | Sigma-Aldrich | C4384 | |
| Citric acid | Supelco | 46933 | |
| Cysteine-HCl | Sigma-Aldrich | C1276 | |
| Glacial acetic acid | Merok | 100063 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | 410225 | |
| HCl | Sigma-Aldrich | H1758 | |
| Na2-EDTA | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| NaCl | SAMCHUN CHEMICALS | S2097 | |
| Papain | Sigma-Aldrich | p4762 | |
| P-DAB | Sigma-Aldrich | D2004 | |
| Perchloric acid | Sigma-Aldrich | 311421 | |
| Sodium acetate | Sigma-Aldrich | S5636 | |
| Sodium hydroxide | Supelco | SX0607N | |
| Sodium phosphate(monobasic) | Sigma-Aldrich | RDD007 | |
| Toluene | Sigma-Aldrich | 244511 | |
| Bioink | |||
| Charicterized FBS | Hyclone | SH30084.03 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Pepsin | Sigma-Aldrich | P7215 | |
| Rose bengal | Sigma-Aldrich | 198250 | |
| RPMI-1640 medium | Thermo Fisher Scientific | 11875093 | |
| Trypan Blue solution | Sigma-Aldrich | T8154 |
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