Pancreatic weefsel-afgeleide extracellulaire matrix Bioink voor het afdrukken van 3D Cell-beladen alvleesklier weefsel constructies
Summary
Decellularized extracellulaire matrix (dECM) kan geschikte micro-omgevings aanwijzingen bieden om de inherente functies van doelweefsels in een Engineered constructie te recapituleren. Dit artikel verheldeert de protocollen voor de decellularisatie van pancreas weefsel, evaluatie van decm bioink van de alvleesklier weefsel, en generatie van 3D-alvleesklier weefsel constructies met behulp van een bioprinten techniek.
Abstract
De transplantatie van pancreas eilandjes is een veelbelovende behandeling voor patiënten die lijden aan type 1 diabetes gepaard met Hypoglykemie en secundaire complicaties. Echter, Islet Transplantatie heeft nog steeds een aantal beperkingen, zoals de lage levensvatbaarheid van getransplanteerde eilandjes als gevolg van slechte eilandje engraftment en vijandige omgevingen. Bovendien, de insuline-producerende cellen onderscheiden van menselijke pluripotente stamcellen hebben beperkte mogelijkheid om te scheiden van voldoende hormonen die de bloedsuikerspiegel kan reguleren; Daarom is het sterk nodig om de rijping te verbeteren door cellen met goede micromilieuaanwijzingen te kweken. In dit artikel, we duidelijkheid protocollen voor het bereiden van een door de alvleesklier weefsel afgeleide decellularized extracellulaire matrix (pdecm) bioink om een gunstige micro-omgeving te bieden die de glucose gevoeligheid van alvleesklier eilandjes kan verhogen, gevolgd door het beschrijven van de processen voor het genereren van 3D-alvleesklier weefsel constructies met behulp van een microextrusie gebaseerde bioprinten techniek.
Introduction
Onlangs is de transplantatie van alvleesklier Islet beschouwd als een veelbelovende behandeling voor patiënten met diabetes type 1. De relatieve veiligheid en minimale invasiviteit van de procedure zijn grote voordelen van deze behandeling1. Echter, het heeft een aantal beperkingen, zoals de lage succespercentage van het isoleren van eilandjes en de bijwerkingen van immunosuppressieve drugs. Bovendien daalt het aantal geënt eilandjes gestaag na transplantatie als gevolg van de vijandige omgeving2. Verschillende biocompatibele materialen zoals alginaat, collageen, poly (melkzuur-co-glycolic zuur) (PLGA) of polyethyleenglycol (PEG) zijn toegepast op het eiland van de alvleesklier transplantatie om deze moeilijkheden te overwinnen.
3D Cell Printing technologie is ontstaan in weefsel Engineering vanwege zijn grote potentieel en hoge prestaties. Onnodig te zeggen, bioinkten staan bekend als belangrijke componenten voor het verstrekken van een geschikte micro-omgeving en het mogelijk maken van de verbetering van cellulaire processen in gedrukte weefsel constructies. Een aanzienlijk aantal afschuifverdunnende hydrogels zoals fibrin, alginaat en collageen worden veel gebruikt als bioinkten. Echter, deze materialen vertonen een gebrek aan structurele, chemische, biologische en mechanische complexiteit in vergelijking met de extracellulaire matrix (ECM) in native weefsel3. Micromilieuaanwijzingen zoals de interacties tussen eilandjes en ECM zijn belangrijke signalen voor het verbeteren van de functie van eilandjes. Decellularized ECM (decm) kan de Weefselspecifieke samenstelling van verschillende ECM-componenten opnieuw maken, waaronder collageen, glycosaminoglycanen (Gags) en glycoproteïnen. Bijvoorbeeld, primaire eilandjes die hun perifere ECMs behouden (bijvoorbeeld, type I, III, IV, V, en VI collageen, laminine, en fibronectin) vertonen lage apoptosis en betere insulinegevoeligheid, wat aangeeft dat weefsel-specifieke cel-matrix interacties belangrijk zijn voor het verbeteren van hun vermogen om te functioneren op dezelfde manier naar oorspronkelijke weefsel4.
In dit document, we verhelderen protocollen voor het bereiden van alvleesklier weefsel afgeleide decellularized extracellulaire matrix (pdecm) bioink om gunstige microenvironmental cues voor het stimuleren van de activiteit en functies van pancreas eilandjes, gevolgd door de processen voor het genereren van 3D alvleesklier weefsel constructies met behulp van een microextrusie gebaseerde bioprinten techniek (Figuur 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit protocol beschreef de ontwikkeling van pdecm-bioinkten en de fabricage van 3D-alvleesklier weefsel constructies met behulp van 3D-celdruktechnieken. Om de micro-omgeving van het doelweefsel in de 3D-engineered weefsel constructie te recapituleren, is de keuze van bioink van cruciaal belang. In een eerdere studie, we gevalideerd dat weefsel-specifieke dECM bioinks gunstig zijn voor het bevorderen van stamcel differentiatie en proliferatie10. In vergelijking met synthetische polymeren, dECM kan …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit onderzoek werd ondersteund door het bio & Medical Technology Development Program van de National Research Foundation (NRF), gefinancierd door de Koreaanse overheid (MSIT) (2017M3A9C6032067) en “ICT consilience Creative Program” (IITP-2019-2011-1-00783) onder toezicht van het IITP (Institute for Information & Communications Technology planning & evaluatie).
Materials
| Biological Safety Cabinets | CRYSTE | PURICUBE 1200 | |
| Deep Freezer | Thermo Scientific Forma | 957 | |
| Digital orbital shaker | DAIHAN Scientific | DH.WSO04010 | |
| Dry oven | DAIHAN Scientific | WON-155 | |
| Freeze dryer | LABCONCO | 7670540 | |
| Fridge | SANSUNG | CRFD-1141 | |
| Grater | ABM | 1415605793 | |
| Inverted Microscopes | Leica | DMi1 | |
| Microcentrifuge | CRYSTE | PURISPIN 17R | |
| Microplate reader | Thermo Fisher Scientific | Multiskan GO | |
| Mini centrifuge | DAIHAN Scientific | CF-5 | |
| Multi-Hotplate Stirrers | DAIHAN Scientific | SMHS-6 | |
| Nanodrop | Thermo Fisher Scientific | ND-LITE-PR | |
| pH benchtop meter | Thermo Fisher Scientific | STARA2110 | |
| Rheometer | TA Instrument | Discovery HR-2 | |
| Vortex Mixer | DAIHAN Scientific | VM-10 | |
| Cirurgical Instruments | |||
| Operating Scissors | Hirose | HC.13-122 | |
| Forcep | Korea Ace Scientific | HC.203-30 | |
| Materials | |||
| 1.7 mL microcentrifuge tube | Axygen | MCT-175-C | |
| 10 ml glass vial | Scilab | SL.VI1243 | |
| 40 µm cell strainer | Falcon | 352340 | |
| 5 L beaker | Dong Sung Science | SDS 2400 | |
| 50 mL cornical tube | Falcon | 352070 | |
| 500 mL beaker | Korea Ace Scientific | KA.23-08 | |
| 500 mL bottle-top vacuum filter | Corning | 431118 | |
| 500 mL plastic container | LOCK&LOCK | INL301 | |
| 96well plate | Falcon | 353072 | |
| Aluminum foil | DAEKYO | ||
| Kimwipe | Kimtech | ||
| Magnetic bar | Korea Ace Scientific | BA.37110-0003 | |
| Mortar and pestle | DAIHAN Scientific | SC.MG100 | |
| Multi-channel pipettor | Eppendorf | 4982000314 | |
| Petri Dish | SPL | 10100 | |
| pH indicator strips | Sigma-Aldrich | 1095350001 | |
| Sieve filter mesh | DAIHAN Scientific | ||
| Decellularization | |||
| 10x pbs | Hyclone | SH30258.01 | |
| 4.7% Peracetic acid | Omegafarm | ||
| 70% ethanol | SAMCHUN CHEMICALS | E0220 SAM | |
| Distilled water | |||
| IPA | SAMCHUN CHEMICALS | samchun I0348 | |
| Triton-X 100 | Biosesang | T1020 | |
| Biochemical assay | |||
| 1,9-Dimethyl-Methylene Blue zinc chloride double salt | Sigma-Aldrich | 341088 | |
| 10 N NaOH | Biosesang | S2018 | |
| Chloramine T | Sigma-Aldrich | 857319 | |
| Chondroitin sulfate A | Sigma-Aldrich | C4384 | |
| Citric acid | Supelco | 46933 | |
| Cysteine-HCl | Sigma-Aldrich | C1276 | |
| Glacial acetic acid | Merok | 100063 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | 410225 | |
| HCl | Sigma-Aldrich | H1758 | |
| Na2-EDTA | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| NaCl | SAMCHUN CHEMICALS | S2097 | |
| Papain | Sigma-Aldrich | p4762 | |
| P-DAB | Sigma-Aldrich | D2004 | |
| Perchloric acid | Sigma-Aldrich | 311421 | |
| Sodium acetate | Sigma-Aldrich | S5636 | |
| Sodium hydroxide | Supelco | SX0607N | |
| Sodium phosphate(monobasic) | Sigma-Aldrich | RDD007 | |
| Toluene | Sigma-Aldrich | 244511 | |
| Bioink | |||
| Charicterized FBS | Hyclone | SH30084.03 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Pepsin | Sigma-Aldrich | P7215 | |
| Rose bengal | Sigma-Aldrich | 198250 | |
| RPMI-1640 medium | Thermo Fisher Scientific | 11875093 | |
| Trypan Blue solution | Sigma-Aldrich | T8154 |
References
- Shapiro, A. J., Pokrywczynska, M., Ricordi, C. Clinical pancreatic islet transplantation. Nature Reviews Endocrinology. 13 (5), 268 (2017).
- Venturini, M., et al. Technique, complications, and therapeutic efficacy of percutaneous transplantation of human pancreatic islet cells in type 1 diabetes: the role of US. Radiology. 234 (2), 617-624 (2005).
- Xie, D., et al. Cytoprotection of PEG-modified adult porcine pancreatic islets for improved xenotransplantation. Biomaterials. 26 (4), 403-412 (2005).
- Sackett, S. D., et al. Extracellular matrix scaffold and hydrogel derived from decellularized and delipidized human pancreas. Scientific Reports. 8 (1), 10452 (2018).
- Kim, J., et al. 3D cell printing of islet-laden pancreatic tissue-derived extracellular matrix bioink constructs for enhancing pancreatic functions. Journal of Materials Chemistry B. 7 (10), 1773-1781 (2019).
- Yi, H. G., et al. A bioprinted human-glioblastoma-on-a-chip for the identification of patient-specific responses to chemoradiotherapy. Nature Biomedical Engineering. 1, (2019).
- Das, S., et al. Decellularized extracellular matrix bioinks and the external stimuli to enhance cardiac tissue development in vitro. Acta Biomaterialia. , (2019).
- Kim, H., et al. Shear-induced alignment of collagen fibrils using 3D cell printing for corneal stroma tissue engineering. Biofabrication. 11 (3), 035017 (2019).
- Huang, H. H., Ramachandran, K., Stehno-Bittel, L. A replacement for islet equivalents with improved reliability and validity. Acta Diabetologica. 50 (5), 687-696 (2013).
- Pati, F., et al. Printing three-dimensional tissue analogues with decellularized extracellular matrix bioink. Nature Communications. 5, 3935 (2014).
- Hussey, G. S., Dziki, J. L., Badylak, S. F. Extracellular matrix-based materials for regenerative medicine. Nature Reviews Materials. 1, (2018).
- Kim, B. S., Kim, H., Gao, G., Jang, J., Cho, D. W. Decellularized extracellular matrix: a step towards the next generation source for bioink manufacturing. Biofabrication. 9 (3), 034104 (2017).
- Gaetani, R., et al. Evaluation of different decellularization protocols on the generation of pancreas-derived hydrogels. Tissue Engineering Part C: Methods. 24 (12), 697-708 (2018).
- Gao, G., et al. Tissue engineered bio-blood-vessels constructed using a tissue-specific bioink and 3D coaxial cell printing technique: a novel therapy for ischemic disease. Advanced Functional Materials. 27 (33), 1700798 (2017).
- La, W. G., et al. Systemically replicated organic and inorganic bony microenvironment for new bone formation generated by a 3D printing technology. RSC Advances. 6 (14), 11546-11553 (2016).
- Lee, H., et al. Development of liver decellularized extracellular matrix bioink for three-dimensional cell printing-based liver tissue engineering. Biomacromolecules. 18 (4), 1229-1237 (2017).
- Choudhury, D., Tun, H. W., Wang, T., Naing, M. W. Organ-derived decellularized extracellular matrix: a game changer for bioink manufacturing?. Trends in Biotechnology. 36 (8), 787-805 (2018).
- Kurpios, N. A., et al. The direction of gut looping is established by changes in the extracellular matrix and in cell: cell adhesion. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (25), 8499-8506 (2008).
- Sakai, T., Larsen, M., Yamada, K. M. Fibronectin requirement in branching morphogenesis. Nature. 423 (6942), 876 (2003).
