3D Hücre Yüklü Pankreas Dokusu Yapıları Baskı için Pankreas Doku Türetilmiş Ekstrasellüler Matrix Bioink
Summary
Hücre dışı matriks (dECM) tasarlanmış bir yapıda hedef dokuların doğal işlevlerini yeniden özetlemek için uygun mikroçevresel ipuçları sağlayabilir. Bu makalede pankreas dokusunun desellülsizasyonu için protokoller açıklanmıştır, pankreas dokusu kaynaklı dECM bioink decm dECM değerlendirilmesi, ve 3D pankreas dokusu üretimi bir biyobaskı tekniği kullanılarak inşa eder.
Abstract
Pankreas adacıklarının nakli hipoglisemi ve sekonder komplikasyonlar eşliğinde tip 1 diyabet muzdarip hastalar için umut verici bir tedaviyöntemidir. Ancak, adacık nakli nin kötü adacık engraftment ve düşmanca ortamlar nedeniyle nakledilen adacıkların düşük canlılığı gibi çeşitli sınırlamalar hala vardır. Buna ek olarak, insan pluripotent kök hücrelerinden farklı insülin üreten hücreler kan şekeri seviyesini düzenleyen yeterli hormonsssalgılamak için sınırlı yeteneği var; bu nedenle, uygun mikroçevresel ipuçları ile hücreleri kültürleme tarafından olgunlaşma iyileştirilmesi kuvvetle gereklidir. Bu makalede, pankreas adacıklarının glikoz duyarlılığını artırabilecek yararlı bir mikroortam sağlamak için pankreas dokusu ndan elde edilen hücre dışı matriks (pdECM) biyoink hazırlanması için protokolleri açıklar, ardından 3D pankreas dokusu oluşturma süreçleri mikroekstrüzyon tabanlı biyobaskı tekniği kullanılarak oluşturur.
Introduction
Son zamanlarda, pankreas adacık nakli tip 1 diyabetli hastalar için umut verici bir tedavi olarak kabul edilmiştir. Göreceli güvenlik ve prosedürün minimal invazivlik bu tedavinin büyük avantajları vardır1. Ancak, izole adacıkların düşük başarı oranı ve immünsupresif ilaçların yan etkileri gibi çeşitli sınırlamalar vardır. Ayrıca, engrafted adacık ların sayısı sürekli olarak ekim sonrası düşmancaçevre2 nedeniyle azalır. Bu zorlukların üstesinden gelmek için pankreas adacık transplantasyonuna aljinat, kollajen, poli (laktik-koglikolik asit) (PLGA) veya polietilen glikol (PEG) gibi çeşitli biyouyumlu malzemeler uygulanmıştır.
3D hücre baskı teknolojisi, büyük potansiyeli ve yüksek performansı nedeniyle doku mühendisliğinde gelişmektedir. Söylemeye gerek yok, bioinks uygun bir mikroortam sağlamak ve basılı doku yapıları hücresel süreçlerin iyileştirilmesi sağlayan önemli bileşenleri olarak bilinir. Fibrin, aljinat ve kollajen gibi makas inceltme hidrojelleri önemli sayıda yaygın bioinks olarak kullanılır. Ancak, bu malzemeler in doğal dokuda ekstrasellüler matris (ECM) ile karşılaştırıldığında yapısal, kimyasal, biyolojik ve mekanik karmaşıklık eksikliği göstermektedir3. Adacıklar ve ECM arasındaki etkileşimler gibi mikroçevresel ipuçları adacıkların işlevini artırmak için önemli sinyallerdir. Hücreli ECM (dECM) kollajen, glikozaminoglikanlar (GAGs) ve glikoproteinler de dahil olmak üzere çeşitli ECM bileşenlerinin dokuya özgü bileşimini yeniden oluşturabilir. Örneğin, periferik AK’larını koruyan birincil adacıklar (örneğin, tip I, III, IV, V ve VI kollajen, laminin ve fibronektin) düşük apoptoz ve daha iyi insülin hassasiyeti sergilerler, böylece dokuya özgü hücre-matriks etkileşimlerinin orijinal doku4’ebenzer şekilde çalışma yeteneklerini artırmak için önemli olduğunu gösterirler.
Bu yazıda, pankreas adacıklarının aktivitesini ve işlevlerini artırmak için yararlı mikroçevresel ipuçları sağlamak için pankreas dokusu kaynaklı hücre dışı matriks (pdECM) bioink hazırlanması için protokolleri açıklamak, bir mikroeksistasyon tabanlı biyobaskı tekniği kullanarak 3D pankreas dokusu yapıları oluşturmak için süreçler takip(Şekil 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokol, pdECM bioinks gelişimi ve 3D hücre baskı teknikleri kullanılarak 3D pankreas dokusu yapıları imalatı açıklanmıştır. 3D mühendislik doku yapısında hedef dokunun mikro ortamını özetlemek için bioink seçimi çok önemlidir. Bir önceki çalışmada, dokuya özgü dECM bioinks kök hücre farklılaşması ve çoğalması teşvik etmek için yararlı olduğunu doğruladı10. Sentetik polimerler ile karşılaştırıldığında, dECM dokuya özgü kompozisyon ve mimarisi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu araştırma, Kore hükümeti (MSIT) (2017M3A9C6032067) ve “BİT Eşzamanlılık Yaratıcı Programı” (IITP-2019-1-00783) tarafından finanse edilen Ulusal Araştırma Vakfı’nın (NRF) Biyo ve Tıbbi Teknoloji Geliştirme programı tarafından desteklenmiştir. IITP (Institute for Information & Communications Technology Planning & Evaluation) tarafından denetlenir.
Materials
| Biological Safety Cabinets | CRYSTE | PURICUBE 1200 | |
| Deep Freezer | Thermo Scientific Forma | 957 | |
| Digital orbital shaker | DAIHAN Scientific | DH.WSO04010 | |
| Dry oven | DAIHAN Scientific | WON-155 | |
| Freeze dryer | LABCONCO | 7670540 | |
| Fridge | SANSUNG | CRFD-1141 | |
| Grater | ABM | 1415605793 | |
| Inverted Microscopes | Leica | DMi1 | |
| Microcentrifuge | CRYSTE | PURISPIN 17R | |
| Microplate reader | Thermo Fisher Scientific | Multiskan GO | |
| Mini centrifuge | DAIHAN Scientific | CF-5 | |
| Multi-Hotplate Stirrers | DAIHAN Scientific | SMHS-6 | |
| Nanodrop | Thermo Fisher Scientific | ND-LITE-PR | |
| pH benchtop meter | Thermo Fisher Scientific | STARA2110 | |
| Rheometer | TA Instrument | Discovery HR-2 | |
| Vortex Mixer | DAIHAN Scientific | VM-10 | |
| Cirurgical Instruments | |||
| Operating Scissors | Hirose | HC.13-122 | |
| Forcep | Korea Ace Scientific | HC.203-30 | |
| Materials | |||
| 1.7 mL microcentrifuge tube | Axygen | MCT-175-C | |
| 10 ml glass vial | Scilab | SL.VI1243 | |
| 40 µm cell strainer | Falcon | 352340 | |
| 5 L beaker | Dong Sung Science | SDS 2400 | |
| 50 mL cornical tube | Falcon | 352070 | |
| 500 mL beaker | Korea Ace Scientific | KA.23-08 | |
| 500 mL bottle-top vacuum filter | Corning | 431118 | |
| 500 mL plastic container | LOCK&LOCK | INL301 | |
| 96well plate | Falcon | 353072 | |
| Aluminum foil | DAEKYO | ||
| Kimwipe | Kimtech | ||
| Magnetic bar | Korea Ace Scientific | BA.37110-0003 | |
| Mortar and pestle | DAIHAN Scientific | SC.MG100 | |
| Multi-channel pipettor | Eppendorf | 4982000314 | |
| Petri Dish | SPL | 10100 | |
| pH indicator strips | Sigma-Aldrich | 1095350001 | |
| Sieve filter mesh | DAIHAN Scientific | ||
| Decellularization | |||
| 10x pbs | Hyclone | SH30258.01 | |
| 4.7% Peracetic acid | Omegafarm | ||
| 70% ethanol | SAMCHUN CHEMICALS | E0220 SAM | |
| Distilled water | |||
| IPA | SAMCHUN CHEMICALS | samchun I0348 | |
| Triton-X 100 | Biosesang | T1020 | |
| Biochemical assay | |||
| 1,9-Dimethyl-Methylene Blue zinc chloride double salt | Sigma-Aldrich | 341088 | |
| 10 N NaOH | Biosesang | S2018 | |
| Chloramine T | Sigma-Aldrich | 857319 | |
| Chondroitin sulfate A | Sigma-Aldrich | C4384 | |
| Citric acid | Supelco | 46933 | |
| Cysteine-HCl | Sigma-Aldrich | C1276 | |
| Glacial acetic acid | Merok | 100063 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | 410225 | |
| HCl | Sigma-Aldrich | H1758 | |
| Na2-EDTA | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| NaCl | SAMCHUN CHEMICALS | S2097 | |
| Papain | Sigma-Aldrich | p4762 | |
| P-DAB | Sigma-Aldrich | D2004 | |
| Perchloric acid | Sigma-Aldrich | 311421 | |
| Sodium acetate | Sigma-Aldrich | S5636 | |
| Sodium hydroxide | Supelco | SX0607N | |
| Sodium phosphate(monobasic) | Sigma-Aldrich | RDD007 | |
| Toluene | Sigma-Aldrich | 244511 | |
| Bioink | |||
| Charicterized FBS | Hyclone | SH30084.03 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Pepsin | Sigma-Aldrich | P7215 | |
| Rose bengal | Sigma-Aldrich | 198250 | |
| RPMI-1640 medium | Thermo Fisher Scientific | 11875093 | |
| Trypan Blue solution | Sigma-Aldrich | T8154 |
References
- Shapiro, A. J., Pokrywczynska, M., Ricordi, C. Clinical pancreatic islet transplantation. Nature Reviews Endocrinology. 13 (5), 268 (2017).
- Venturini, M., et al. Technique, complications, and therapeutic efficacy of percutaneous transplantation of human pancreatic islet cells in type 1 diabetes: the role of US. Radiology. 234 (2), 617-624 (2005).
- Xie, D., et al. Cytoprotection of PEG-modified adult porcine pancreatic islets for improved xenotransplantation. Biomaterials. 26 (4), 403-412 (2005).
- Sackett, S. D., et al. Extracellular matrix scaffold and hydrogel derived from decellularized and delipidized human pancreas. Scientific Reports. 8 (1), 10452 (2018).
- Kim, J., et al. 3D cell printing of islet-laden pancreatic tissue-derived extracellular matrix bioink constructs for enhancing pancreatic functions. Journal of Materials Chemistry B. 7 (10), 1773-1781 (2019).
- Yi, H. G., et al. A bioprinted human-glioblastoma-on-a-chip for the identification of patient-specific responses to chemoradiotherapy. Nature Biomedical Engineering. 1, (2019).
- Das, S., et al. Decellularized extracellular matrix bioinks and the external stimuli to enhance cardiac tissue development in vitro. Acta Biomaterialia. , (2019).
- Kim, H., et al. Shear-induced alignment of collagen fibrils using 3D cell printing for corneal stroma tissue engineering. Biofabrication. 11 (3), 035017 (2019).
- Huang, H. H., Ramachandran, K., Stehno-Bittel, L. A replacement for islet equivalents with improved reliability and validity. Acta Diabetologica. 50 (5), 687-696 (2013).
- Pati, F., et al. Printing three-dimensional tissue analogues with decellularized extracellular matrix bioink. Nature Communications. 5, 3935 (2014).
- Hussey, G. S., Dziki, J. L., Badylak, S. F. Extracellular matrix-based materials for regenerative medicine. Nature Reviews Materials. 1, (2018).
- Kim, B. S., Kim, H., Gao, G., Jang, J., Cho, D. W. Decellularized extracellular matrix: a step towards the next generation source for bioink manufacturing. Biofabrication. 9 (3), 034104 (2017).
- Gaetani, R., et al. Evaluation of different decellularization protocols on the generation of pancreas-derived hydrogels. Tissue Engineering Part C: Methods. 24 (12), 697-708 (2018).
- Gao, G., et al. Tissue engineered bio-blood-vessels constructed using a tissue-specific bioink and 3D coaxial cell printing technique: a novel therapy for ischemic disease. Advanced Functional Materials. 27 (33), 1700798 (2017).
- La, W. G., et al. Systemically replicated organic and inorganic bony microenvironment for new bone formation generated by a 3D printing technology. RSC Advances. 6 (14), 11546-11553 (2016).
- Lee, H., et al. Development of liver decellularized extracellular matrix bioink for three-dimensional cell printing-based liver tissue engineering. Biomacromolecules. 18 (4), 1229-1237 (2017).
- Choudhury, D., Tun, H. W., Wang, T., Naing, M. W. Organ-derived decellularized extracellular matrix: a game changer for bioink manufacturing?. Trends in Biotechnology. 36 (8), 787-805 (2018).
- Kurpios, N. A., et al. The direction of gut looping is established by changes in the extracellular matrix and in cell: cell adhesion. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (25), 8499-8506 (2008).
- Sakai, T., Larsen, M., Yamada, K. M. Fibronectin requirement in branching morphogenesis. Nature. 423 (6942), 876 (2003).
