Introduction
Streptococcus pneumoniae, un colonisateur commun de la communauté polymicrobien du nasopharynx, est en mesure de rivaliser avec d'autres pneumocoques et des espèces étroitement apparentées par la production de peptides antimicrobiens produits par des bactéries (des bactériocines). Chaque souche pneumococcique entièrement séquencé examiné à ce jour contient une version de la b acteriocin- l ike p eptide lieu, blp. Production de bactériocine par le pneumocoque a été démontré un rôle important dans les résultats de la fois in vitro et in vivo à concurrence de 1 à 4. Dynamique de compétition sont influencés par l'expression de diverses protéines ainsi que les bactériocines de l'immunité apparentées en réponse à une phéromone peptide spécifique. L'induction de la BLP locus est commandé par un système de détection de quorum dans lequel une phéromone peptidique, BLPC, se lie à la kinase de capteur, BlpH, et initie une cascade de signalisation aboutissant à latranscription du locus 5,6 blp. Il ya quatre variations alléliques de BLPC qui lient chacun à sa BlpH apparenté 6. Pour la cellule de survivre aux effets de son propre bactériocine, les gènes qui codent pour des protéines apparentées à l'immunité sont transcrits sur le même opéron que chacun des gènes des bactériocines. Tuer se produit si une souche de compétiteur n'est pas en mesure de réguler à la hausse le locus blp en réponse à la phéromone ou exogènes, si la souche est dépourvue du gène de l'immunité spécifique requis pour la protection. Le complexe de transporteur, BlpAB est requis pour la sécrétion et le traitement de la phéromone de peptides et les peptides de bactériocines 2,4. Récemment, il a été montré qu'une proportion importante des souches de pneumocoques sont les "tricheurs" qui signifie qu'ils ont une mutation dans le gène conservé APLE qui les rend incapables de sécréter des phéromones et des bactériocines 1,2. Ces souches sont capables de répondre à BLPC exogène 2 sécrétée par hennissementsouches de perçage permettant la production de protéines d'immunité.
Bien que, préparations brutes de bactériocines de surnageants peuvent être préparés à partir de souches de producteurs utilisant des méthodes biochimiques étapes pour atteindre la pureté, cette approche n'est pas utile pour le criblage de grandes collections d'isolats et si le niveau d'expression des bactériocines est faible dans le bouillon cultivé cultures 2,7- 9. Le test de recouvrement est utilisé comme un moyen rapide pour étudier la dynamique de concurrence entre les souches qui peuvent exister in vitro. Pour ce faire, une souche pneumococcique est pré-inoculées sur une plaque de gélose et on a laissé croître pour atteindre des concentrations bactériennes locales suffisantes pour l'induction de la BLP locus. Une seconde souche est ensuite inoculée dans une solution d'agar mou fondu qui est ensuite appliqué sur la souche pré-inoculé à tester pour la sensibilité. Pour évaluer l'activité du locus blp (indépendante de l'activité inhibitrice), les souches peuvent être superposées avec une série de three souches rapporteurs BLPC décrites précédemment. Ces souches ont été construites pour contenir l'un des trois allèles blpH différents qui répondent aux trois phéromones les plus courantes BLPC sécrétées par le pneumocoque. Les souches rapporteurs ont un gène lacZ intégré qui est sous le contrôle d'un promoteur dépendant de BlpH et portent une délétion dans le gène qui prévient BLPC auto-stimulation 10,11.
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Protocol
1 Préparation du producteur Strain
- Déposer sur une souche pneumococcique à tester pour la production des bactériocines sur un sang de mouton soja tryptique plaque de gélose de 5% à partir de -80 ° C les stocks de congélation.
NOTE: L'utilisation de plaques de sang pour la croissance initiale de la souche à tester pour l'inhibition augmente considérablement la reproductibilité du dosage. En outre, d'autres souches non-pneumococciques qui produisent des bactériocines peuvent être utilisés même si les conditions de croissance peuvent avoir besoin d'être modifié pour un organisme spécifique. Nous avons utilisé Streptococcus mitis et Lactococcus lactis dans le test de superposition avec succès. - Incuber la plaque pendant une nuit (O / N) à 37 ° C avec 5% de CO 2.
- Après incubation de la souche productrice, préparer la plaque de gélose de soja trypsique (TSA) par pipetage de 3000 à 4000 unités de catalase sur des plaques contenant 25 ml de TSA et propager la solution de catalase à l'aide de billes de verre stériles. Laissez la plaque sécher pendant environ 10 minutes sousune enceinte de sécurité biologique.
- Recueillir une quantité visible de bactéries sur une pointe de pipette. Poignarder la pointe de la pipette dans la plaque TSA séché.
NOTE: Plus d'une souche productrice peut être poignardé dans une seule plaque TSA. Il est important d'espacer les coups de sorte que des halos résultant ne se chevauchent pas.- Si possible, les bactériocine producteur connu en tant que témoin positif et la souche à être utilisés dans la superposition en tant que contrôle négatif.
REMARQUE: Les contrôles positifs et négatifs sont déjà publiées et sont disponibles sur demande 10.
- Si possible, les bactériocine producteur connu en tant que témoin positif et la souche à être utilisés dans la superposition en tant que contrôle négatif.
- Incuber la plaque TSA contenant de multiples coups de couteau à 37 ° C avec 5% de CO 2 pendant 6 heures.
2. la constitution de stocks de glycérol de la souche Overlay
- Préparation des stocks de glycerol (cultures cultivées jusqu'à la phase mi-exponentielle et ensuite stockés à -80 ° C après addition de glycerol) avant le jour de l'essai d'incrustation. Inoculer 5-10 colonies de str pneumocoqueain à tester pour la sensibilité ou de la sécrétion de phéromone dans un milieu Todd-Hewitt avec 0,5% d'extrait de levure (THY).
REMARQUE: Construction de BLPC journalistes inductibles a été décrit précédemment et 2 souches sont disponibles sur demande. - Incuber 5-10 colonies dans des tubes de verre de 5 ml de THY avec couvercles bien fermés dans un bain d'eau à 37 ° sans agitation.
- Incuber les cultures à 37 ° C jusqu'à ce qu'elles atteignent une DO 620 de 0,3 à 0,5.
NOTE: Cela prendra environ 4-5 heures en fonction de la souche utilisée.- Retourner doucement le tube à quelques reprises avant de mesure de la DO.
- Si l'essai ne peut pas être effectuée de la même journée ou de la souche sera utilisé plusieurs fois dans le futur, faire des stocks de glycerol et reprendre l'expérience à une date ultérieure. Pour les stocks de glycerol, le glycerol ajouter aux cultures à une concentration finale de 20%. cultures aliquotes de 1,5 ml dans des microtubes et conserver à -80 ° C. NOTE: Les échantillons peuvent être sTored pendant des mois à -80 ° C. Si ce n'est pas la constitution de stocks de glycérol, utilisez des échantillons directement pour le dosage de recouvrement.
3 Essai de superposition
- Juste avant de superposer l'application, mélanger les composants de superposition. Dans un tube conique de 15 ml, ajouter 5 ml de THY, 3000-4000 U de catalase, et 200 pi de la culture de bouillon de souche de recouvrement qui a été soit cultivé ce jour-là ou un stock de glycérol de la culture qui a été décongelé à température ambiante. Si l'on utilise la souche rapporteuse, ajouter 50 ul de X-gal (40 mg / ml) au mélange de revêtement. Utilisez un tube conique par plaque.
- Equilibrer mélange superposition à la température ambiante avant l'addition de fusion TSA.
- Retirer la plaque TSA avec la souche poignardé de l'incubateur. Faire fondre le solide TSA en ondes et le garder à 55 ° C bain d'eau jusqu'au moment de servir. Ajouter 3 ml de TSA fondu avec 1,5% de gélose refroidie à 55 ° C pour recouvrir mélange.
- Préparer le mélange immédiatement avant le revêtement de pipetage, le mélange commence à se solidifier trèsrapidement. REMARQUE: Si le revêtement commence à se solidifier avant le placage, les résultats seront impossibles à interpréter.
- Mélanger le mélange de recouvrement par aspiration et à plusieurs reprises avec une pipette 5 ml en faisant attention de ne pas introduire de bulles dans le mélange. Pipette lentement le mélange de recouvrement directement sur la plaque TSA poignardé. Conservez la plaque sur la paillasse pendant quelques minutes pour permettre l'agar durcir.
- Ne pas faire pivoter la plaque de distribuer le mélange de recouvrement, ce qui ralentira la croissance de la culture poignardé dans la superposition.
- Placer soigneusement la plaque TSA avec superposition en 37 ° C incubateur contenant 5% de CO 2 O / N (environ 16-18 h).
- Respecter les plaques après une nuit de croissance. Les plaques doivent apparaître opaque à partir de la croissance de la souche de recouvrement sauf dans des zones où l'inhibition de la signalisation ou de la phéromone a eu lieu. Ils apparaissent comme des zones soit clair ou bleu autour de la souche poignardé, respectivement.
NOTE: Bien que mesurements du diamètre de compensation bleu ou peuvent être déterminées pour l'évaluation quantitative, les différences de diamètre peuvent également varier en fonction de la quantité de bactéries qui a été enfoncée dans la plaque. Le test de superposition est un test qualitatif, une évaluation quantitative doit être interprétée avec prudence. Toute compensation visible par rapport au témoin négatif est considérée comme l'activité.
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Representative Results
Il existe deux résultats possibles dans le test de superposition. Il devrait être possible de voir la croissance de la souche poignardé après une nuit d'incubation. Sur la figure 1A, la souche est sensible à la superposition des bactériocines produites. Une zone de dégagement peut être visualisé entourant la contrainte poignardé. En outre, la souche de tourbillonnement enfoncée dans le mélange de recouvrement est possible et peut être vu dans la Figure 1A. Dans la figure 1B, la souche de superposition est à l'abri des bactériocines étant sécrétées comme l'a noté l'absence d'un halo entourant le coup. Il est également possible que la souche ne sécrète pas poignardé bactériocines. Pour l'essai de signalisation, deux résultats sont possibles. La souche poignardé est capable de sécréter des phéromones qui interagit avec l'histidine kinase de la souche de recouvrement, telle que perçue par la décomposition de X-gal, comme illustré sur la figure 2A. Si la phéromone n'active pas la transcription de l'locus blp dans la souche de reporter, ou si la souche poignardé ne sécrète pas phéromone, répartition de X-gal ne se produira pas, comme illustré à la figure 2B.
Figure 1 Aspect de blp L'inhibition et l'immunité dans un essai de superposition. (A) Souche P133, un producteur de bactériocine a été ajouté dans une plaque TSA et laisse croître pendant 6 heures. Souche P250, une souche bactériocine négatif, a été inoculé dans la superposition. Les plaques ont été photographiées après O / N incubation. Une zone de dégagement est indiqué par la flèche. (B) Souche P133 a été ajouté dans une plaque TSA et incubée pendant 6 heures. Souche 130, contenant une mutation du cadre de lecture dans APLE, a été inoculé dans la superposition. Après O / N incubation, les plaques ont été photographiées.
Figure 2 phéromone activation de locus blp médiation dans l'essai de signalisation. (A) Souche P133, un type BLPC R6 sécréteur, a été ajouté dans une plaque TSA et incubée pendant 6 heures. Souche P981, un type BLPC R6 journaliste avec une délétion dans BLPC, a été inoculé dans la superposition. Les photographies ont été prises après O / N incubation. (B) P133 a été ajouté dans une plaque TSA. Après une incubation de 6 heures, P845, un BLPC de type P164 journaliste avec une délétion dans BLPC, a été inoculé dans la superposition. Les photographies ont été prises après O / N croissance.
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Discussion
Ce test de superposition est un moyen rapide de déterminer l'étendue des activités des producteurs de bactériocines et de démontrer les interactions compétitives qui peuvent survenir entre les souches de pneumocoques. Le dosage de recouvrement peut être adapté pour utiliser pour le criblage de souches multiples pour la production de bactériocine sur une seule plaque. Nous avons passé au crible avec succès de grandes collections de souches avec ce dosage en utilisant un duplicateur de 48 broches pour inoculer plaques SBA de la moitié d'une plaque de 96 puits. Après une nuit d'incubation, la croissance est transférée à la plaque TSA utilisez le réplicateur et percer la surface de la gélose de la plaque avec les broches du réplicateur.
D'autres peptides antimicrobiens des bactéries sécrétées qui sont réglementées dans une manière dépendante de la densité comme lantibiotiques peuvent également être examinés à l'aide de la technique de superposition 7,12,13. Ceci est particulièrement utile lors de la purification d'un lantibiotique ou bactériocine est difficile. Bien que les surnageants peuvent être testés pour antimicrobienneactivité, l'expression de BLP dérivé bactériocines dans un bouillon est très limitée ou inexistante (données non présentées). Le dosage permet de recouvrement pour la croissance à une densité supérieure qui n'est pas obtenu lorsque les organismes sont cultivés dans un liquide. La croissance sur un milieu solide pourrait également refléter plus fidèlement les conditions de croissance in vivo du nasopharynx.
Le dosage de recouvrement peut également être utilisé pour examiner la capacité de la souche poignardé à sécréter la signalisation spécifique phéromone bactériocine. Ceci exige la construction d'une souche rapporteur qui exprime la protéine de récepteur de phéromone et dans lequel un promoteur sensible à la phéromone est placé en amont du gène lacZ. Évaluation de la sécrétion de phéromones par une souche poignardé est particulièrement utile en tant que lecture de l'activité du locus blp si la souche poignardé n'inhibe pas la souche de superposition. L'incapacité à inhiber la souche de recouvrement peut être le résultat d'un locus blp non fonctionnel (par exemple dans unLa souche de mutation avec un transporteur) ou parce que les bactériocines sécrétées ne sont pas actifs contre la souche de superposition particulier testé. La superposition de souche rapporteur fournit des informations supplémentaires que le lieu dans le producteur dispose d'un transporteur entièrement fonctionnel système à deux composants et APLE permettant une régulation positive et la sécrétion de la phéromone. Cela implique que les bactériocines codées sont également sécrétées.
Il ya des limites à ce test. Le dosage de superposition est un essai qualitatif, alors la comparaison entre l'activité inhibitrice de la sécrétion de phéromone ou de différentes souches doivent être faite avec soin. Tarifs et les conditions de croissance doivent être considérées lorsque l'on compare différentes souches parce que le résultat de l'analyse s'appuie fortement sur le taux de la superposition et de souches poignardé croissance. L'addition de catalase à la fois la plaque et le recouvrement est important afin d'éliminer les effets inhibiteurs de pneumocoque H 2 O 2 sur la productioncroissance de la souche de recouvrement, en particulier pour l'utilisation de catalase négatif organisme dans l'overlay. Compte tenu de la diversité connue de contenu génomique de la population contre le pneumocoque, aucune activité inhibitrice vu avec ce dosage ne peut pas être automatiquement attribuée au locus blp sans analyse par délétion.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trypticase Soy Agar with 5% Sheep Blood | Fisher | B21261X | For growth from freezer cultures |
| Catalase | Sigma | C100-500mg | 4,741 Units per plate |
| Todd Hewitt Broth + Yeast Extract (THY) | Fisher | DF0492-17-6 | 30 g of THB, 5 g yeast extract, 1 L ddH2O autoclave |
| Trypticase Soy Broth + Agar plates (TSA) | Fisher | B11768 | 30 g of TS, 15 g agar, 1 L ddH2O autoclave |
| 5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside (X-gal) | Sigma | B4252-50MG | Dissolve in dimethylformamide |
| Petri dishes | Fisher | FB0875712 | |
| Spectrophometer | Measures the OD620 of cultures | ||
| 37 °C water bath | |||
| 37 °C incubator with 5% CO2 | |||
| 15 ml conical tube |
References
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