Introduction
Streptococcus pneumoniae, en vanlig colonizer av blandingsflora fellesskap av nese-svelgrommet, er i stand til å konkurrere med andre pneumokokker og nært beslektede arter gjennom produksjon av bacterially produsert antimikrobielle peptider (bakteriociner). Hver fullt sekvensert pneumokokk belastning undersøkt hittil inneholder en versjon av b acteriocin- l ike p eptide locus, BLP. Bakteriocinproduksjonen ved pneumococcus har vist seg å være viktig i utfallet av både in vitro og in vivo konkurranse 1-4. Konkurrerende dynamikk blir påvirket av ekspresjonen av forskjellige bakteriociner sammen med beslektede proteiner immunitet som respons på et spesifikt peptid feromon. Induksjon av BLP-locus er kontrollert av en quorums- følersystem, hvor et peptid feromon, BlpC bindes til sensoren kinase, BlpH, og initierer en signalkaskade som resulterer itranskripsjon av BLP locus 5,6. Det er fire allele varianter av BlpC at hvert bind til kognatreseptoren BlpH seks. For cellen til å overleve virkningen av sin egen bakteriocin, er gener som koder for beslektede proteiner immunitetstranskribert i samme operon som hver av bakteriocinet gener. Killing oppstår hvis en konkurrent belastningen er ikke i stand til å oppregulere BLP locus som respons på eksogen feromon eller, hvis belastningen mangler spesifikk immunitet genet som kreves for beskyttelse. Transportøren kompleks, er BlpAB nødvendig for sekresjon og prosessering av peptidet feromon og bakteriocinet peptider 2,4. Nylig har det blitt vist at en betydelig andel av pneumokokkstammer er "cheaters" betyr at de har en konservert mutasjon i blpA genet som gjør dem ute av stand til å utskille feromoner og bakteriociner 1,2. Disse stammer er i stand til å svare på eksogen BlpC 2 utskilt av vrinskkjedelige stammer som muliggjør produksjon av immunitets proteiner.
Selv, rå preparater av bakteriosinene fra supernatants kan tilberedes fra produsent stammer bruker biokjemiske metoder skritt for å oppnå renhet, er denne tilnærmingen ikke nyttig for screening store samlinger av isolater og dersom nivået av bakteriocinproduksjonen uttrykk er lav i buljong vokst kulturer 2,7- 9. Overleggs assay brukes som en hurtig måte til å undersøke de konkurrerende dynamikk mellom stammer som kan finnes in vitro. For å gjøre dette, er et pneumokokk stamme pre-inokulert på en agar-plate og tillatt å vokse for å oppnå lokale bakterielle konsentrasjoner som er tilstrekkelig for induksjon av BLP locus. En annen stamme ble deretter inokulert i en smeltet bløt agar-løsning som påføres deretter over den forhånds inokulert belastning for å teste følsomheten. For å evaluere om aktiviteten til BLP locus (uavhengig av hemmende aktivitet), kan påkjenningen bli belagt med en serie three tidligere beskrevet BlpC reporter stammer. Disse stammene var konstruert for å inneholde en av tre forskjellige blpH alleler som reagerer på de tre vanligste BlpC feromoner skilles ut av pneumokokker. Rapportør-stammer har en integrert lacZ-genet som er under kontroll av en BlpH avhengige promotor og bærer en delesjon i genet blpC som forhindrer selvstimulering 10,11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Utarbeidelse av Producer Strain
- Streak en pneumokokk påkjenning å bli testet for bakteriocinproduksjonen på en 5% saueblod tryptisk soya agar plate fra -80 ° C fryser aksjer.
MERK: bruk av blodplater etter innledende vekst av stammen å bli testet for inhibisjon øker reproduserbarheten av analysen. Dessuten kan andre ikke-pneumokokkstammer som produserer bakteriociner brukes selv om vekstbetingelser kan måtte modifiseres for en bestemt organisme. Vi har brukt Streptococcus mitis og Lactococcus lactis i overlay analysen vellykket. - Inkuber platen over natten (O / N) ved 37 ° C med 5% CO2.
- Etter inkubering av produsenten belastning, forberede tryptisk soya-agar (TSA) plate ved å pipettere 3000 til 4000 enheter av katalase på plater inneholdende 25 ml av TSA og spre katalase løsning ved hjelp av sterile glasskuler. La platen tørke i omtrent 10 minutter underet biologisk sikkerhetskabinett.
- Samle en synlig mengde bakterier på en pipette tips. Dolke pipettespissen inn i tørket TSA plate.
MERK: Mer enn én produsent belastningen kan bli knivstukket i en enkelt TSA plate. Det er viktig å plass ut stikk slik at resulterende haloer ikke overlapper hverandre.- Hvis det er mulig, inneholde kjente bakteriocin produsenten som en positiv kontroll, og belastningen som skal brukes i overlappingen som en negativ kontroll.
MERK: Positive og negative kontroller er tidligere har blitt publisert og er tilgjengelig på forespørsel 10.
- Hvis det er mulig, inneholde kjente bakteriocin produsenten som en positiv kontroll, og belastningen som skal brukes i overlappingen som en negativ kontroll.
- Inkuber TSA plate som inneholder flere stikk ved 37 ° C med 5% CO2 i 6 timer.
2. Lage glyserol aksjer i Overlay Strain
- Forbered glyserol aksjer (kulturer dyrket til mid-eksponensiell fase, og deretter lagret ved -80 ° C etter tilsetning av glycerol) før dagen for overlegget assay. Vaksinere 5-10 kolonier av pneumokokk strain å bli testet for følsomhet eller feromon sekresjon i Todd-Hewitt medium med 0,5% gjærekstrakt (THY).
MERK: Bygging av BlpC induserbare journalister har tidligere blitt beskrevet 2 og stammer er tilgjengelig på forespørsel. - Inkuber 5-10 kolonier i glassrør med 5 ml THY med tett lukket lokk i en 37 ° C vannbad uten risting.
- Inkuber kulturer ved 37 ° C inntil de når en OD 620 på 0,3 til 0,5.
MERK: Dette vil ta ca 4-5 timer avhengig av belastningen brukes.- Snu røret forsiktig et par ganger før du måle OD.
- Hvis forsøket ikke kan utføres i den samme dag eller belastningen vil bli brukt flere ganger i fremtiden, gjør glyserol aksjer og gjenoppta eksperimentet på et senere tidspunkt. For glyserol aksjer, tilsett glycerol til kulturer til en sluttkonsentrasjon på 20%. Delmengde kulturer i 1,5 ml mikrosentrifugerør og oppbevar ved -80 ° C. MERK: Prøver kan være stored for måneder ved -80 ° C. Hvis ikke gjør glyserol aksjer, bruker prøvene direkte for overlegg analysen.
3. Overlay Assay
- Like før overlappe søknad, bland overleggs komponenter. I et 15 ml konisk rør, tilsett 5 ml THY, 3000-4000 U av katalase, og 200 pl av den strekkoverlegget buljongkultur som enten ble dyrket den dagen, eller en glycerol lager av den kultur som ble tint ved romtemperatur. Ved hjelp av reporter-stammen, tilsett 50 pl av X-gal (40 mg / ml) for å overlegget blandingen. Bruk en konisk rør per plate.
- Stabilisere overlegg blandingen ved romtemperatur før tilsetning av smeltet TSA.
- Fjern TSA plate med knivstukket belastning fra inkubatoren. Smelt solid TSA i mikrobølgeovn og holde ved 55 ° C vannbad til den er klar til bruk. Tilsett 3 ml av smeltet TSA med 1,5% agar ble avkjølt til 55 ° C for å overlappe blandingen.
- Klargjør overlegg blandingen umiddelbart før pipettering, vil blandingen begynner å stivne sværtraskt. MERK: Hvis overlegget begynner å stivne før plating, vil resultatene bli uninterpretable.
- Bland overlegg blandingen ved å pipettere opp og ned flere ganger med en 5 ml pipette være forsiktig for ikke å innføre bobler i blandingen. Sakte pipette overlay blanding direkte på knivstukket TSA plate. Hold platen på stasjonære for noen minutter slik at den agar å stivne.
- Ikke roter plate for å fordele overlay blanding, vil dette trekke veksten fra knivstukket kultur inn overlegget.
- Nøye TSA plate med overlegg i 37 ° C inkubator inneholdende 5% CO 2 O / N (ca. 16-18 timer).
- Observere platene etter natten vekst. Platene bør være ugjennomskinnelige fra veksten av stammen overlegg bortsett fra i områder hvor inhibering eller feromon signalering har funnet sted. Disse vises som enten klare eller blå soner rundt knivstukket belastning, henholdsvis.
MERK: Selv om Måltements av diameteren av blå eller lysning kan bestemmes for kvantitativ vurdering, forskjeller i diameter kan også variere avhengig av mengden av bakterier som ble stukket inn i platen. Overleggs analysen er en kvalitativ analyse, noen kvantitativ vurdering bør tolkes med forsiktighet. Enhver synlig lysning i forhold til den negative kontroll er å anse som aktivitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det er to mulige utfall i overlay analysen. Det bør være mulig å vise veksten av stukket belastningen etter inkubering over natten. I figur 1A, er belastningen overlegg følsomme for bakteriociner blir produsert. En sone med klaring kan visualiseres som omgir stukket belastning. I tillegg er virvlende av belastningen stukket inn i overlegget blandingen mulig, og kan sees i figur 1A. I figur 1B, er belastningen overlegg immun mot bakteriociner blir utskilt som det fremgår av et fravær av et halogen som omgir stikk. Det er også mulig at det stukket belastningen ikke utskiller bakteriociner. For signaleringsanalyse, to forskjellige resultater er mulig. Den stukket belastningen er i stand til å utskille feromon som samvirker med histidin kinase av stammen overlegg, sett gjennom nedbryting av X-gal, som vist i figur 2A. Hvis feromonet ikke aktiverer transkripsjon avBLP-locus i reporter-stammen, eller hvis stukket belastningen ikke utskille feromon, nedbryting av X-gal vil ikke forekomme slik som vist i figur 2B.
Figur 1. Utseende av BLP mediert hemming og immunitet i et overlegg analysen. (B) Stamme P133, et bakteriocin produsent ble tilsatt i en TSA-plate og tillatt å vokse i 6 timer. Strain P250, en bakteriocin negativ belastning, ble podet inn overlegget. Platene ble fotografert etter O / N inkubasjon. En sone med klaring er angitt ved pilen. (B) Stamme P133 ble tilsatt i en TSA-plate og inkubert i 6 timer. Strain 130, som inneholder en rammeskift mutasjon i blpA, ble podet inn overlegget. Etter O / N inkubasjon ble platene fotografert.
Figur 2. Pheromone mediert aktivering av BLP locus i signale analysen. (B) Stamme P133, en BlpC type R6 secretor, ble tilsatt i en TSA-plate og inkubert i 6 timer. Strain P981, en BlpC type R6 reporter med en sletting i BlpC, ble podet inn overlegget. Bildene ble tatt etter at O / N inkubasjon. (B) P133 ble tilsatt i en TSA plate. Etter inkubering i 6 timer, P845, en BlpC typen P164 reporter med en delesjon i BlpC, ble inokulert i overlappingen. Bildene ble tatt etter at O / N vekst.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne overlay-analysen er en rask måte å bestemme området for aktivitet for bakteriocinløsning produsenter og å vise et bredt interaksjoner som kan forekomme blant pneumokokkstammer. Det overliggende assay kan tilpasses til bruk for screening av flere stammer for bakteriocinproduksjonen på en enkelt plate. Vi har med hell vist store strekk samlinger med dette assay ved å bruke en 48-pinners replikator å inokulere SBA platene fra den ene halvdel av en 96-brønns plate. Etter inkubering over natten, blir veksten overføres til TSA platen ved hjelp av replikator og gjennomhulling av agar overflate av platen med stiftene på replikator.
Andre bacterially utskilles antimikrobielle peptider som er regulert i en tetthetsavhengig måte som lantibiotika kan også bli undersøkt ved hjelp av overlay teknikk 7,12,13. Dette er spesielt nyttig når rensing av et bakteriocin eller lantibiotikum er vanskelig. Skjønt supernatanter kan bli testet for antimikrobiellaktivitet, er ekspresjon av BLP avledet bakteriociner kokes i meget begrenset eller ikke-eksisterende (data ikke vist). Overleggs analysen tillater vekst til en høyere tetthet, hvilket ikke oppnås når organismene dyrkes i flytende. Vekst på et solid medium kanskje også tettere reflektere in vivo vekstvilkår i nasopharynx.
Overleggs analysen kan også bli brukt til å undersøke muligheten av stukket belastning å utskille bakteriocinet bestemt signal feromon. Dette krever konstruksjon av en rapportør stamme som uttrykker feromon reseptorprotein og hvori et feromon som reagerer promoter er plassert oppstrøms for lacZ-genet. Styrking av feromon sekresjon av en knivstukket belastningen er spesielt nyttig som en avlesning av BLP locus aktivitet hvis den knivstukket belastningen ikke hemmer belastningen overlegg. Den manglende evne til å hemme strekklegget kan være et resultat av en ikke-funksjonell BLP locus (for eksempel i ensil med en transportør-mutasjon), eller fordi de bakteriociner utskilles ikke er aktive mot den bestemte overlegg strekktestet. Reporteren belastningen overlegg gir ytterligere informasjon som locus i produsenten har et fullt funksjonelt tokomponent system og BlpA transporter slik at for oppregulering og sekresjon av feromonet. Dette innebærer at alle kodede bakteriociner blir også utskilt.
Det er noen begrensninger for denne analysen. Overleggs-analysen er en kvalitativ bestemmelse, slik at sammenligninger mellom den inhiberende aktivitet eller feromon sekresjon av forskjellige stammer må gjøres med omhu. Vekstrater og betingelser bør tas i betraktning når man sammenligner ulike stammer fordi utfallet av analysen er avhengig tungt på vekst på overlegget og stakk stammer. Tilsetningen av katalase til både platen og overlegget er viktig for å fjerne de inhibitoriske effektene av pneumokokk H 2 O 2-produksjon påvekst av stammen overlegg, særlig ved bruk av katalase negativ organisme i overlappingen. Gitt den kjente mangfold av genomisk innhold i pneumokokk populasjonen, noe inhibitorisk aktivitet sett med denne analysen kan ikke uten videre tilbakeføres til BLP locus uten deletional analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trypticase Soy Agar with 5% Sheep Blood | Fisher | B21261X | For growth from freezer cultures |
| Catalase | Sigma | C100-500mg | 4,741 Units per plate |
| Todd Hewitt Broth + Yeast Extract (THY) | Fisher | DF0492-17-6 | 30 g of THB, 5 g yeast extract, 1 L ddH2O autoclave |
| Trypticase Soy Broth + Agar plates (TSA) | Fisher | B11768 | 30 g of TS, 15 g agar, 1 L ddH2O autoclave |
| 5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside (X-gal) | Sigma | B4252-50MG | Dissolve in dimethylformamide |
| Petri dishes | Fisher | FB0875712 | |
| Spectrophometer | Measures the OD620 of cultures | ||
| 37 °C water bath | |||
| 37 °C incubator with 5% CO2 | |||
| 15 ml conical tube |
References
- Dawid, S., Roche, A. M., Weiser, J. N. The blp bacteriocins of Streptococcus pneumoniae mediate intraspecies competition both in vitro and in vivo. Infect Immun. 75 (1), 443-451 (2007).
- Sawa, N., et al. Isolation and characterization of enterocin W, a novel two-peptide lantibiotic produced by Enterococcus faecalis NKR-4-1. Appl Environ Microbiol. 78 (3), 900-903 (2012).
- Kochan, T. J., Dawid, S. The HtrA protease of Streptococcus pneumoniae controls density-dependent stimulation of the bacteriocin blp locus via disruption of pheromone secretion. J Bacteriol. 195 (7), 1561-1572 (2013).
- Lux, T., Nuhn, M., Hakenbeck, R., Reichmann, P. Diversity of bacteriocins and activity spectrum in Streptococcus pneumoniae. J Bacteriol. 189 (21), 7741-7751 (2007).
- Reichmann, P., Hakenbeck, R. Allelic variation in a peptide-inducible two-component system of Streptococcus pneumoniae. FEMS Microbiol Lett. 190 (2), 231-236 (2000).
- Saizieu, A., et al. Microarray-based identification of a novel Streptococcus pneumoniae regulon controlled by an autoinduced peptide. J Bacteriol. 182 (17), 4696-4703 (2000).
- Barbour, A., Philip, K., Muniandy, S. Enhanced production, purification, characterization and mechanism of action of salivaricin 9 lantibiotic produced by Streptococcus salivarius NU10. PLoS One. 8 (10), 77751 (2013).
- Wladyka, B., et al. Isolation, biochemical characterization, and cloning of a bacteriocin from the poultry-associated Staphylococcus aureus strain CH-91. Appl Microbiol Biotechnol. 97 (16), 7229-7239 (2013).
- Shea, E. F., et al. Bactofencin a, a new type of cationic bacteriocin with unusual immunity. 4 (6), 00498-00413 (2013).
- Son, M. R., et al. Conserved mutations in the pneumococcal bacteriocin transporter gene, blpA, result in a complex population consisting of producers and cheaters. MBio. 2 (5), (2011).
- Kochan, T. J., Dawid, S. The HtrA protease of Streptococcus pneumoniae controls density-dependent stimulation of the bacteriocin blp locus via disruption of pheromone secretion. J Bacteriol. 195, 1561-1572 (2013).
- Widdick, D. A., et al. Cloning and engineering of the cinnamycin biosynthetic gene cluster from Streptomyces cinnamoneus cinnamoneus DSM 40005. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (7), 4316-4321 (2003).
- Begley, M., Cotter, P. D., Hill, C., Ross, R. P. Identification of a novel two-peptide lantibiotic, lichenicidin, following rational genome mining for LanM proteins. Appl Environ Microbiol. 75 (17), 5451-5460 (2009).
