Introduction
Streptococcus pneumoniae, un colonizador común de la comunidad polimicrobiana de la nasofaringe, es capaz de competir con otros neumococos y especies estrechamente relacionadas con la producción de péptidos antimicrobianos producidos por bacterias (bacteriocinas). Cada cepa de neumococo totalmente secuenciado-examinado hasta la fecha contiene una versión de la l ike locus p eptide b acteriocin-, BLP. La producción de bacteriocina por el neumococo ha demostrado ser importante en el resultado de tanto in vitro como in vivo en la competición 1-4. Dinámica competitiva están influenciados por la expresión de diversas bacteriocinas junto con proteínas de la inmunidad afines en respuesta a una feromona específica de péptido. Inducción del locus BLP está controlado por un sistema de detección de quórum en la que una feromona péptido, BLPC, se une a la quinasa sensor, BlpH, e inicia una cascada de señalización que resulta en lala transcripción del locus 5,6 BLP. Hay cuatro variaciones alélicas de BLPC que se unen cada uno a su BlpH afines 6. Para la célula para sobrevivir a los efectos de su propia bacteriocina, los genes que codifican proteínas de la inmunidad afines se transcriben en el mismo operón como cada uno de los genes de bacteriocina. Killing se produce si una cepa competidor no es capaz de regular positivamente el locus BLP en respuesta a la feromona exógeno o, si la cepa carece del gen de inmunidad específica necesaria para la protección. El complejo transportador, BlpAB se requiere para la secreción y el procesamiento de la feromona de péptidos y los péptidos de bacteriocina 2,4. Recientemente, se ha demostrado que una proporción significativa de cepas neumocócicas son "tramposos" que significa que tienen una mutación en el gen conservado BLPA que las hace incapaces de secretar feromonas y bacteriocinas 1,2. Estas cepas son capaces de responder a BLPC exógeno 2 secretada por relinchocepas aburridas que permitan la producción de proteínas de la inmunidad.
Aunque, preparaciones crudas de bacteriocinas a partir de sobrenadantes se pueden preparar a partir de cepas de productores usando métodos pasos bioquímicos para lograr la pureza, este enfoque no es útil para el cribado de grandes colecciones de cepas y si el nivel de expresión de bacteriocina es baja en caldos de cultivo crecido 2,7- 9. La superposición de ensayo se utiliza como una forma rápida para investigar la dinámica competitiva entre las cepas que puedan existir en vitro. Para ello, una cepa neumocócica es pre-inocularon en una placa de agar y se dejaron crecer hasta alcanzar concentraciones bacterianas locales suficientes para la inducción del locus BLP. Una segunda cepa se inocula luego en una solución de agar blando fundido que se aplica entonces sobre la cepa de pre inoculado para la prueba de sensibilidad. Para evaluar la actividad del locus BLP (independiente de la actividad inhibitoria), las cepas pueden ser superpuestos con una serie de juree reportero cepas BLPC descritos anteriormente. Se construyeron estas cepas para contener uno de los tres alelos blpH diferentes que responden a las tres feromonas BLPC más comunes secretadas por el neumococo. Las cepas indicadoras tienen un gen lacZ integrado que está bajo el control de un promotor dependiente de BlpH y llevar a una deleción en el gen BLPC que impide la auto-estimulación 10,11.
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Protocol
1 Preparación de la cepa productora
- Racha de una cepa neumocócica a ensayar para la producción de bacteriocinas en una sangre de oveja de soja tríptico placa de agar 5% desde -80 ° C congelador stocks.
NOTA: La utilización de placas de sangre para el crecimiento inicial de la cepa a ensayar para la inhibición aumenta en gran medida la reproducibilidad del ensayo. Además, otras cepas no neumocócicas que producen bacteriocinas pueden ser utilizados aunque pueden necesitar ser modificados para un organismo específico condiciones de crecimiento. Hemos utilizado Streptococcus mitis y Lactococcus lactis en el ensayo de recubrimiento con éxito. - Incubar la placa durante la noche (O / N) a 37 ° C con 5% de CO 2.
- Después de la incubación de la cepa productora, preparar la placa de agar de soja tríptico (TSA) pipeteando 3000 a 4000 unidades de catalasa sobre placas que contienen 25 ml de TSA y se extendió la solución de catalasa usando perlas de vidrio estériles. Deje que la placa se seque durante 10 minutos bajouna cabina de seguridad biológica.
- Se recoge una cantidad visible de bacterias en una punta de la pipeta. Apuñalar a la punta de la pipeta en la placa de TSA seca.
NOTA: Mas de una cepa productora puede ser apuñalado en una sola placa de TSA. Es importante espaciar las puñaladas de manera que halos resultantes no se solapan.- Si es posible, incluir conocido productor de bacteriocina como un control positivo y la cepa para ser utilizado en la superposición como un control negativo.
NOTA: Los controles positivos y negativos son han sido publicados con anterioridad y están disponibles bajo petición 10.
- Si es posible, incluir conocido productor de bacteriocina como un control positivo y la cepa para ser utilizado en la superposición como un control negativo.
- Incubar la placa TSA contiene múltiples puñaladas a 37 ° C con CO2 al 5% durante 6 horas.
2. Hacer reservas de glicerina de la cepa Overlay
- Preparar stocks de glicerol (cultivos desarrollados a mediados de la fase exponencial y luego almacenados a -80 ° C después de la adición de glicerol) antes del día del ensayo de superposición. Inocular 5-10 colonias de str neumocócicaain a hacerse la prueba de sensibilidad o secreción de feromonas en medio Todd-Hewitt con extracto de levadura al 0,5% (THY).
NOTA: Construcción de BLPC reporteros inducibles se ha descrito previamente 2 y cepas están disponibles bajo petición. - Incubar 5-10 colonias en tubos de vidrio con 5 ml de THY con tapas bien cerrados, en un baño de agua a 37 ° C sin agitación.
- Incubar cultivos a 37 ° C hasta que llegan a un OD 620 de 0,3 a 0,5.
NOTA: Esto tomará aproximadamente 4-5 horas, dependiendo de la cepa utilizada.- Invierta suavemente el tubo un par de veces antes de la medición de la densidad óptica.
- Si el experimento no se puede realizar el mismo día o de la cepa se puede utilizar varias veces en el futuro, hacer stocks de glicerol y reanudar el experimento en una fecha posterior. Para las poblaciones de glicerol, glicerol añadir a los cultivos a una concentración final de 20%. Culturas alícuotas en tubos de microcentrífuga de 1,5 ml y almacenar a -80 ° C. NOTA: Las muestras pueden ser sreada durante meses a -80 ° C. Si no hacer stocks de glicerol, utilizar muestras directamente para el ensayo de superposición.
3. Overlay Ensayo
- Justo antes de la aplicación superponer, mezclar los componentes de superposición. En un tubo cónico de 15 ml, añadir 5 ml de THY, 3.000-4.000 U de catalasa, y 200 l de caldo de cultivo cepa superposición que se ha cultivado ese día o una acción de glicerol de la cultura que se descongela a temperatura ambiente. Si se utiliza la cepa reportero, añadir 50 l de X-gal (40 mg / ml) a la mezcla de superposición. Utilice un tubo cónico por placa.
- Equilibrar mezcla de recubrimiento a temperatura ambiente antes de la adición de TSA fundido.
- Retire la placa de TSA con la cepa apuñalado de la incubadora. Derretir sólido TSA en el microondas y mantener a 55 ° C baño de agua hasta que esté listo para usar. Añadir 3 ml de TSA fundido con 1,5% de agar se enfría a 55 ° C para superponer mezcla.
- Preparar la mezcla de superposición inmediatamente antes de pipeteo, la mezcla empezará a solidificar muyrápidamente. NOTA: Si la cubierta comienza a solidificarse antes de enchapado, los resultados serán imposibles de interpretar.
- Mezclar la mezcla de superposición pipeteando arriba y abajo varias veces con una pipeta de 5 ml con cuidado de no introducir burbujas en la mezcla. Lentamente pipetear mezcla de superposición directamente sobre la placa de TSA apuñalado. Mantenga la placa sobre la mesa de trabajo para pocos minutos permitiendo que el agar se endurezca.
- No gire la placa para distribuir la mezcla de superposición, este se tire el crecimiento de la cultura apuñalado en la superposición.
- Con cuidado, coloque la placa de TSA con plantilla a 37 ° C incubadora que contiene 5% de CO 2 O / N (aproximadamente 16 a 18 h).
- Observar las placas después del crecimiento durante la noche. Las placas deben aparecer opaco de crecimiento de la cepa de superposición excepto en las zonas donde se ha producido la inhibición o la feromona de señalización. Estos aparecerán como zonas bien claros o azules alrededor de la cepa apuñalado, respectivamente.
NOTA: Aunque measurelemen- del diámetro de la compensación de color azul o se pueden determinar para la evaluación cuantitativa, las diferencias en el diámetro también puede variar dependiendo de la cantidad de bacterias que se clavó en la placa. La superposición de ensayo es un ensayo cualitativo, cualquier evaluación cuantitativa debe ser interpretado con cautela. Cualquier compensación visible en comparación con el control negativo se considera como actividad.
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Representative Results
Hay dos posibles resultados en el ensayo de recubrimiento. Debe ser posible ver el crecimiento de la cepa acuchillado después de la incubación durante la noche. En la Figura 1A, la cepa es sensible a la superposición de las bacteriocinas que se producen. Un espacio libre se puede visualizar que rodea la cepa apuñalado. Además, remolino de la cepa acuchillado en la mezcla de superposición es posible y se puede ver en la Figura 1A. En la Figura 1B, la cepa de superposición es inmune a las bacteriocinas siendo secretadas como se indica por la ausencia de un halo que rodea la puñalada. También es posible que la cepa acuchillado no está secretando bacteriocinas. Para el ensayo de señalización, dos resultados diferentes son posibles. La cepa acuchillado es capaz de secretar feromonas que interactúa con el histidina quinasa de la cepa de superposición, como se ve a través de la descomposición de X-gal como se muestra en la Figura 2A. Si la feromona no activa la transcripción delBLP locus en la cepa reportero, o si la cepa acuchillado no secreta feromona, no se producen descomposición de X-gal como se muestra en la Figura 2B.
Figura 1. Aspecto de la inhibición y la inmunidad mediada por BLP en un ensayo de superposición. (A) Cepa P133, un productor de bacteriocina, se añadieron a una placa de TSA y se dejó crecer durante 6 h. P250 Strain, una cepa de bacteriocinas negativo, se inoculó en la superposición. Las placas fueron fotografiadas después de O / N de incubación. Un espacio libre se indica por la flecha. P133 (B) La cepa se inoculó en una placa de TSA y se incubaron durante 6 hr. Strain 130, que contiene una mutación de desplazamiento de marco en BLPA, se inoculó en la superposición. Después de O / N de la incubación, las placas fueron fotografiados.
Figura 2. Pheromone mediada activación de locus BLP en ensayo de señalización. (A) P133 Strain, un tipo BLPC R6 secretor, se inoculó en una placa de TSA y se incubaron durante 6 horas. P981 Strain, un reportero R6 tipo BLPC con una deleción en BLPC, se inoculó en la superposición. Las fotografías fueron tomadas después de O / N de incubación. (B) P133, se añadieron a una placa de TSA. Después de la incubación durante 6 horas, P845, un reportero tipo P164 BLPC con una deleción en BLPC, se inoculó en la superposición. Las fotografías fueron tomadas después de O / N crecimiento.
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Discussion
Esta superposición de ensayo es una manera rápida de determinar la gama de actividades para los productores de bacteriocinas y para demostrar las interacciones competitivas que pueden ocurrir entre las cepas de neumococo. El ensayo de superposición se puede adaptar a utilizar para la detección de múltiples cepas para la producción de bacteriocina en una sola placa. Hemos analizado con éxito grandes colecciones de cepas con este ensayo mediante el uso de un replicador de 48 pines para inocular placas de SBA de la mitad de una placa de 96 pocillos. Después de incubación durante la noche, el crecimiento se transfiere a la placa de TSA utilizando el replicador y la perforación de la superficie de agar de la placa con los pasadores de la replicador.
Otros péptidos antimicrobianos por bacterias secretadas que son reguladas de una manera dependiente de la densidad como lantibióticos también pueden ser examinadas usando la técnica de superposición 7,12,13. Esto es especialmente útil cuando es difícil la purificación de una bacteriocina o lantibiótico. Aunque los sobrenadantes se pueden ensayar para antimicrobianoactividad, expresión de las bacteriocinas BLP derivado en caldo es muy limitada o inexistente (datos no mostrados). El ensayo de superposición permite el crecimiento a una densidad más alta que no se logra cuando los organismos se cultivan en líquido. Crecimiento en un medio sólido también podría reflejar más estrechamente las condiciones de crecimiento in vivo de la nasofaringe.
El ensayo de superposición también puede ser utilizado para examinar la capacidad de la cepa acuchillado para secretar la feromona de señalización específica bacteriocina. Esto requiere la construcción de una cepa reportero que expresa la proteína del receptor de feromonas y en el que un promotor sensible a feromona se coloca aguas arriba del gen lacZ. Valoración de la secreción de feromona por una cepa acuchillado es particularmente útil como una lectura de la actividad locus BLP si la cepa acuchillado no inhibe la cepa de superposición. La incapacidad para inhibir la cepa de superposición podría ser el resultado de un locus BLP no funcional (tal como en uncepa con una mutación transportador) o porque las bacteriocinas secretadas no son activos frente a la cepa en particular de superposición probado. La superposición reportero cepa proporciona información adicional que el locus en el productor tiene un transportador totalmente funcional sistema de dos componentes y BLPA lo que permite la regulación positiva y la secreción de la feromona. Esto implica que cualquier bacteriocinas codificados también son secretadas.
Hay algunas limitaciones a este ensayo. El ensayo de superposición es un ensayo cualitativo, lo que las comparaciones entre la actividad inhibidora de la secreción de feromonas o de diferentes cepas tienen que hacerse cuidadosamente. De precios y condiciones de crecimiento se deben considerar cuando se comparan diferentes cepas debido a que el resultado de la prueba depende en gran medida la tasa de crecimiento de la superposición y cepas apuñalado. La adición de catalasa a la placa y la superposición es importante con el fin de eliminar los efectos inhibitorios de neumocócica H 2 O 2 de producción en lacrecimiento de la cepa de superposición, en particular cuando se usa organismo catalasa negativo en la superposición. Dada la diversidad conocida de contenido genómico en la población neumocócica, cualquier actividad inhibidora visto con este ensayo no puede atribuirse automáticamente a la locus BLP sin un análisis de deleción.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trypticase Soy Agar with 5% Sheep Blood | Fisher | B21261X | For growth from freezer cultures |
| Catalase | Sigma | C100-500mg | 4,741 Units per plate |
| Todd Hewitt Broth + Yeast Extract (THY) | Fisher | DF0492-17-6 | 30 g of THB, 5 g yeast extract, 1 L ddH2O autoclave |
| Trypticase Soy Broth + Agar plates (TSA) | Fisher | B11768 | 30 g of TS, 15 g agar, 1 L ddH2O autoclave |
| 5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside (X-gal) | Sigma | B4252-50MG | Dissolve in dimethylformamide |
| Petri dishes | Fisher | FB0875712 | |
| Spectrophometer | Measures the OD620 of cultures | ||
| 37 °C water bath | |||
| 37 °C incubator with 5% CO2 | |||
| 15 ml conical tube |
References
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