Introduction
Streptococcus pneumoniae, en gemensam kolonisatör av polymikrobiella gemenskap nasofarynx, kan konkurrera med andra pneumokocker och närbesläktade arter genom produktion av bakteriellt producerade antimikrobiella peptider (bakteriociner). Varje fullt sekvenser pneumokock-stammen undersöktes hittills innehåller en version av b acteriocin- l ike p eptide locus, BLP. Bakteriocinet produktion med pneumokocker har visat sig vara viktiga i resultatet av både in vitro och in vivo konkurrens 1-4. Konkurrensutvecklingen påverkas av uttrycket av olika bakteriociner tillsammans med besläktade immunitets proteiner som svar på en specifik peptid feromon. Induktion av BLP lokus styrs av en quorum sensing system, i vilket en peptid feromon, BlpC, binder till sensorn kinas, BlpH, och initierar en signaleringskaskad som resulterar i dentranskription av BLP locus 5,6. Det finns fyra alleliska variationer av BlpC att varje binder till dess besläktade BlpH 6. För cellen att överleva effekterna av sin egen bakteriocin är de gener som kodar för besläktade immunitetsproteiner transkriberas på samma operon som var och en av de bakteriocin gener. Dödande uppstår om en konkurrent-stam inte är i stånd att uppreglera BLP lokus som svar på exogent feromon eller, om stammen saknar specifik immunitet genen krävs för skydd. Transportören komplexet, BlpAB erfordras för utsöndring och bearbetning av peptiden feromon och bakteriocinet peptiderna 2,4. Nyligen har det visats att en betydande andel av pneumokockstammar är "fuskare" innebär att de har en konserverad mutation i blpA gen som gör dem oförmögna att utsöndra feromoner och bakteriociner 1,2. Dessa stammar har möjlighet att svara på exogen BlpC 2 utsöndras av gnäggatråkiga stammar som möjliggör produktion av immunitets proteiner.
Även om, råa beredningar av bakteriociner från supernatanter kan framställas från producentstammar använder biokemiska metoder steg för att uppnå renhet, är detta tillvägagångssätt inte är användbart för att screena stora samlingar av isolat, och om nivån av bakteriocinet uttryck är lågt i buljong odlade kulturer 2,7- 9. Den överliggande analysen används som ett snabbt sätt att undersöka konkurrensdynamiken mellan stammar som kan finnas in vitro. För att göra detta är en pneumokock stam förväg ympas på en agarplatta och fick växa för att uppnå lokala bakterie tillräckliga koncentrationer för induktion av BLP locus. En andra stammen inokuleras sedan i en smält mjukagar lösning vilken sedan appliceras över pre-ympades stam för att testa för känslighet. För att utvärdera om aktiviteten i BLP locus (oberoende av hämmande aktivitet), kan stammar överlagras med en serie av three tidigare beskrivna BlpC reporterstammar. Dessa stammar konstruerades för att innehålla en av tre olika blpH alleler som svarar på de tre vanligaste BlpC feromoner utsöndras av pneumokocker. Reporter stammar har en integrerad lacZ-gen som är under kontroll av en BlpH beroende promotorn och bär en deletion i blpC genen som förhindrar självstimulering 10,11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1 Beredning av Producer Strain
- Streak en pneumokocker stam som ska testas för bakteriocin produktion på en 5% fårblod tryptisk agarplatta från -80 ° C frys lager.
OBS: Användning av blodplattor för initial tillväxt av stammen som ska testas för inhibition ökar kraftigt reproducerbarhet av analysen. Dessutom kan andra icke-pneumokockstammar som producerar bakteriociner användas även om tillväxtförhållanden kan behöva ändras för en viss organism. Vi har använt Streptococcus mitis och Lactococcus lactis i overlay-analys med framgång. - Inkubera plattan över natten (O / N) vid 37 ° C med 5% CO2.
- Efter inkubation av producentstammen, förbereda den tryptiska soja-agar (TSA) platta genom pipettering 3000 till 4000 enheter katalas på plattor innehållande 25 ml TSA och sprida katalas lösningen med sterila glaspärlor. Låt plattan torka under ca 10 min underett biologiskt säkerhetsskåp.
- Samla en synlig mängd bakterier på en pipettspets. Stab pipettspetsen i den torkade TSA plattan.
OBS: Mer än en producent stam kan knivhuggen i en enda TSA platta. Det är viktigt att utrymmet ut stick så att resulterande ljusgårdarna inte överlappar varandra.- Om möjligt, innefattar kända bakteriocinet producent som positiv kontroll och stammen som ska användas i överlagringen som en negativ kontroll.
OBS: Positiva och negativa kontroller är har tidigare publicerats och finns tillgängliga på begäran 10.
- Om möjligt, innefattar kända bakteriocinet producent som positiv kontroll och stammen som ska användas i överlagringen som en negativ kontroll.
- Inkubera TSA-platta innehållande flera stick vid 37 ° C med 5% CO2 under 6 timmar.
2. Göra Glycerol Lagren av Overlay Strain
- Förbered glycerol lager (kulturer odlas till mitten av exponentiell fas och sedan förvaras vid -80 ° C efter tillsats av glycerol) före dagen för overlay-analysen. Inokulera 5-10 kolonier av pneumokocker strain testas för känslighet eller feromonutsöndring i Todd-Hewitt medium med 0,5% jästextrakt (THY).
OBS: Konstruktion av BlpC inducerbara reportrar har tidigare beskrivits 2 och stammar finns tillgängliga på begäran. - Inkubera 5-10 kolonier i glasrör med 5 ml THY med väl tillslutet lock i ett 37 ° C vattenbad utan att skaka.
- Inkubera kulturer vid 37 ° C tills de når ett OD 620 på 0,3 till 0,5.
OBS: Detta kommer att ta ca 4-5 timmar beroende på vilken stam som används.- Vänd försiktigt röret några gånger före mäta OD.
- Om försöket inte kan utföras på samma dag eller stammen kommer att användas flera gånger i framtiden, göra glycerolstamlösningar och återuppta försöket vid en senare tidpunkt. För glycerolstamlösningar, till glycerol till kulturerna till en slutlig koncentration av 20%. Alikvotera kulturer i 1,5 ml mikrorör och förvara vid -80 ° C. OBS: Prov kan vara svakas i månader vid -80 ° C. Om inte gör glycerol lager, använder prover direkt för overlay-analys.
3. Overlay-analys
- Precis före överdraga ansökan, blanda överlagringskomponenter. I en 15 ml koniskt rör, tillsätt 5 ml THY, 3000-4000 U katalas, och 200 pl av overlay-stammen buljongkultur som antingen odlades den dagen eller en glycerol lager av kulturen som tinades i rumstemperatur. Vid användning av rapportörstam, lägg 50 pl av X-gal (40 mg / ml) till det överliggande blandningen. Använd ett koniskt rör per platta.
- Jämvikta overlay blandningen vid rumstemperatur före tillsats av smält TSA.
- Ta bort TSA plattan med knivhuggen stam från inkubatorn. Smält fast TSA i mikrovågsugn och hålla vid 55 ° C vattenbad tills den ska användas. Lägg 3 ml smält TSA med 1,5% agar kyles till 55 ° C för att överlagra blandningen.
- Förbered overlay blandningen omedelbart före pipettering, kommer blandningen börjar stelna mycketsnabbt. OBS: Om över börjar stelna innan plätering, kommer resultaten att vara tolkningsbara.
- Blanda overlay blandningen genom att pipettera upp och ned flera gånger med en 5 ml pipett försiktigt så att inte införa bubblor i blandningen. Sakta pipett overlay blandning direkt på knivhuggen TSA plattan. Håll plattan på bänk i några minuter som tillåter agar härda.
- Vrid inte plattan att fördela overlay blandningen, kommer detta att dra tillväxten från knivhuggen kulturen i overlay.
- Placera försiktigt TSA plattan med overlay i 37 ° C inkubator innehållande 5% CO2 O / N (ca 16-18 timmar).
- Observera plattorna efter natten tillväxt. Plattorna ska visas ogenomskinliga från tillväxt av overlay-stammen utom i områden där hämning eller feromonsignalering har inträffat. Dessa kommer att visas som antingen klara eller blå zoner runt knivhuggen stammen, respektive.
OBS: Även om MEASURements av diametern på blå eller clearing kan bestämmas för kvantitativ bedömning, skillnader i diameter kan också variera beroende på hur mycket bakterier som knivhöggs i plattan. Den över-analysen är en kvalitativ analys, en kvantitativ bedömning bör tolkas med försiktighet. All synlig clearing jämfört med den negativa kontrollen betraktas som aktivitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det finns två möjliga utfall i overlay-analysen. Det bör vara möjligt att se tillväxt av hackat stammen efter inkubation över natten. I figur 1 A, är overlay stam känslig för bakteriociner som produceras. Ett fria utrymmet kan visualiseras kring knivhuggen stammen. Dessutom är virvling av hackat stammen in i overlay blandning möjlig och kan ses i Figur 1A. I Figur 1B är overlay stammen immuna mot bakteriociner som utsöndras som noterats av en avsaknad av en gloria kring stab. Det är också möjligt att den knivhuggen stammen inte utsöndrar bakteriociner. För signalanalys, två olika utfall är möjliga. Den stabbed stammen är i stånd att utsöndra feromon som interagerar med histidin kinas av överlägget stam, såsom ses genom nedbrytningen av X-gal, såsom visas i figur 2A. Om feromonet inte aktiverar transkription avBLP lokus i rapportörstammen eller om hackat stammen inte utsöndrar feromon, nedbrytning av X-gal inte kommer att uppstå, såsom visas i figur 2B.
Figur 1 Utseende av BLP hämning och immunitet i en overlay-analys. (A) Stam P133, en bakteriocin producent spetsades in i en TSA platta och tilläts växa under 6 tim. Stam P250, ett bakteriocin negativ stam, ympades in i overlay. Plattorna fotograferade efter O / N inkubation. En fria utrymmet som anges av pilen. (B) Stam P133 spetsades in i en TSA plattan och inkuberas under 6 tim. Stam 130, som innehåller en ramskiftsmutation i blpA, ympades in i overlay. Efter O / N inkubering plattorna fotograferades.
Figur 2 Feromon medierad aktivering av BLP locus i signalanalys. (A) Stam P133, en BlpC typ R6 secretor, spetsades in i en TSA plattan och inkuberas under 6 tim. Stam P981, en BlpC typ R6 reporter med en deletion i BlpC, ympades in i overlay. Fotografier togs efter O / N inkubation. (B) P133 spetsades i en TSA platta. Efter inkubation under 6 h, P845, en BlpC typ P164 reporter med en deletion i BlpC, ympades in i overlay. Fotografier togs efter O / N tillväxt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denna overlay-analys är ett snabbt sätt att bestämma området för aktivitet för bakteriocin producenter och visa konkurrenskraftiga interaktioner som kan uppstå bland pneumokockstammar. Den över analysen kan anpassas för att användas för screening av flera stammar för bakteriocin produktion på en enda skylt. Vi har framgångsrikt screenas stora töjnings samlingar med denna analys genom att använda en 48-pin replicator att inokulera SBA-plattor från en halv av en 96-brunnars platta. Efter inkubation över natten, är tillväxten överförs till TSA plattan med hjälp av replikatorn och piercing agarytan av plattan med stiften i replikatorn.
Andra bakteriellt utsöndrade antimikrobiella peptider som regleras i en täthet beroende sätt som lantibiotika kan också undersökas med hjälp av överlagringstekniken 7,12,13. Detta är särskilt användbart när rening av ett bakteriocin eller lantibiotikum är svårt. Även supernatanter kan testas för antimikrobiellaktivitet, är mycket begränsad eller obefintlig uttryck för BLP härrör bakteriociner i buljong (data visas ej). Den overlay analysen möjliggör tillväxt till en högre täthet som inte uppnås när organismer odlas i flytande. Tillväxt på ett fast medium kan också närmare reflektera villkoren i nasofarynx tillväxt in vivo.
Den överliggande analysen kan också användas för att undersöka möjligheten för knivhuggen stammen att utsöndra bakteriocinet specifika signalerings feromon. Detta kräver konstruktion av en reporterstam som uttrycker feromonreceptorprotein och i vilket en feromonkänslig promotor är placerad uppströms om lacZ-genen. Värdering av feromonutsöndring av en knivhuggen stam är särskilt användbar som en avläsning av BLP locus aktivitet om den knivhuggen stammen inte hämmar overlay-stammen. Oförmågan att inhibera överlägget stam skulle kunna vara resultatet av en icke-funktionell BLP lokus (såsom i enstam med en transportör mutation) eller på grund av bakteriociner utsöndras inte aktivt mot viss över stammen testas. Reportern stammen overlay ger ytterligare information som locus i producenten har ett fullt fungerande tvåkomponentsystem och BlpA transportör möjliggör uppreglering och utsöndring av feromon. Detta innebär att alla kodade bakteriociner också utsöndras.
Det finns vissa begränsningar i denna analys. Den över-analysen är en kvalitativ analys, så jämförelser mellan hämmande aktivitet eller feromonsekretion av olika stammar måste göras noggrant. Tillväxttakten och villkor bör beaktas när man jämför olika stammar, eftersom resultatet av analysen är starkt beroende av tillväxten i överlägget och knivhögg stammar. Tillsatsen av katalas till både plattan och överlägg är viktigt i syfte att avlägsna de hämmande effekterna av pneumokock H 2 O 2 produktion påtillväxt av overlay-stammen, särskilt vid användning av katalas negativ organism i overlay. Med tanke på den kända mångfald av genomiskt innehåll i pneumokock populationen, någon inhiberande aktivitet ses med denna analys kan inte automatiskt tillskrivas den BLP lokuset utan utelämningsvarianter analys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trypticase Soy Agar with 5% Sheep Blood | Fisher | B21261X | For growth from freezer cultures |
| Catalase | Sigma | C100-500mg | 4,741 Units per plate |
| Todd Hewitt Broth + Yeast Extract (THY) | Fisher | DF0492-17-6 | 30 g of THB, 5 g yeast extract, 1 L ddH2O autoclave |
| Trypticase Soy Broth + Agar plates (TSA) | Fisher | B11768 | 30 g of TS, 15 g agar, 1 L ddH2O autoclave |
| 5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside (X-gal) | Sigma | B4252-50MG | Dissolve in dimethylformamide |
| Petri dishes | Fisher | FB0875712 | |
| Spectrophometer | Measures the OD620 of cultures | ||
| 37 °C water bath | |||
| 37 °C incubator with 5% CO2 | |||
| 15 ml conical tube |
References
- Dawid, S., Roche, A. M., Weiser, J. N. The blp bacteriocins of Streptococcus pneumoniae mediate intraspecies competition both in vitro and in vivo. Infect Immun. 75 (1), 443-451 (2007).
- Sawa, N., et al. Isolation and characterization of enterocin W, a novel two-peptide lantibiotic produced by Enterococcus faecalis NKR-4-1. Appl Environ Microbiol. 78 (3), 900-903 (2012).
- Kochan, T. J., Dawid, S. The HtrA protease of Streptococcus pneumoniae controls density-dependent stimulation of the bacteriocin blp locus via disruption of pheromone secretion. J Bacteriol. 195 (7), 1561-1572 (2013).
- Lux, T., Nuhn, M., Hakenbeck, R., Reichmann, P. Diversity of bacteriocins and activity spectrum in Streptococcus pneumoniae. J Bacteriol. 189 (21), 7741-7751 (2007).
- Reichmann, P., Hakenbeck, R. Allelic variation in a peptide-inducible two-component system of Streptococcus pneumoniae. FEMS Microbiol Lett. 190 (2), 231-236 (2000).
- Saizieu, A., et al. Microarray-based identification of a novel Streptococcus pneumoniae regulon controlled by an autoinduced peptide. J Bacteriol. 182 (17), 4696-4703 (2000).
- Barbour, A., Philip, K., Muniandy, S. Enhanced production, purification, characterization and mechanism of action of salivaricin 9 lantibiotic produced by Streptococcus salivarius NU10. PLoS One. 8 (10), 77751 (2013).
- Wladyka, B., et al. Isolation, biochemical characterization, and cloning of a bacteriocin from the poultry-associated Staphylococcus aureus strain CH-91. Appl Microbiol Biotechnol. 97 (16), 7229-7239 (2013).
- Shea, E. F., et al. Bactofencin a, a new type of cationic bacteriocin with unusual immunity. 4 (6), 00498-00413 (2013).
- Son, M. R., et al. Conserved mutations in the pneumococcal bacteriocin transporter gene, blpA, result in a complex population consisting of producers and cheaters. MBio. 2 (5), (2011).
- Kochan, T. J., Dawid, S. The HtrA protease of Streptococcus pneumoniae controls density-dependent stimulation of the bacteriocin blp locus via disruption of pheromone secretion. J Bacteriol. 195, 1561-1572 (2013).
- Widdick, D. A., et al. Cloning and engineering of the cinnamycin biosynthetic gene cluster from Streptomyces cinnamoneus cinnamoneus DSM 40005. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (7), 4316-4321 (2003).
- Begley, M., Cotter, P. D., Hill, C., Ross, R. P. Identification of a novel two-peptide lantibiotic, lichenicidin, following rational genome mining for LanM proteins. Appl Environ Microbiol. 75 (17), 5451-5460 (2009).
