Introduction
폐렴 구균, 비 인두의 polymicrobial 지역 사회의 일반적인 식민지 개척자는, 세균 생성 된 항균 펩타이드 (박테리오신)의 생산을 통해 다른 폐렴 구균과 밀접하게 관련 종과 경쟁 할 수있다. 현재까지 조사마다 완전히 순서가 폐렴 구균 균주는 B의 acteriocin- 리터의 이케 페이지의 eptide 궤적, BLP의 버전이 포함되어 있습니다. 폐렴 구균에 의하여 생산 박테리오신은 양의 시험 관내 결과 및 생체 내 경쟁 1-4에 중요한 것으로 입증되었다. 경쟁적인 역학 특정 펩티드 페로몬에 응답하여 동족 내성 단백질과 함께 다양한 박테리오신의 발현에 의해 영향을 받는다. BLP 궤적 유도 펩티드 페로몬, BlpC는, 센서 키나아제, BlpH에 결합되는 정족수 인식 시스템에 의해 제어하고, 그 결과 신호 캐스케이드를 개시한다BLP 궤적 5,6의 전사. BlpC의 사 대립 유전자 변형이 있습니다 자사의 동족 BlpH 6 각 바인드. 셀 자체 박테리오신의 효과 살아남 들어 동족 내성 단백질을 인코딩하는 유전자는 유전자 박테리오신 각각 같은 오페론에 전사된다. 변형 방지에 필요한 특정 내성 유전자를 결여하는 경우 경쟁자 균주는 외인성 페로몬에 응답 BLP 궤적을 상향 조절 할 수없는 경우, 또는 죽이는 발생한다. 수송 복합체, BlpAB이 분비 및 처리 펩타이드 페로몬과 박테리오신 펩티드 2,4 필요합니다. 최근에는 폐렴 구균 균주의 상당한 부분들이없는 그들과 박테리오신 1,2 페로몬 분비 렌더링 blpA 유전자의 보존 된 돌연변이를 의미하는 "사기꾼"가 있다고 밝혀졌다. 이 균주는 울음 소리에 의해 분비되는 외인성 BlpC 2에 응답 할 수 있습니다면역 단백질의 생산을 허용 보링 균주.
상청액으로부터 박테리오신의 조질 제제는 순도를 달성하는 생화학 방법의 단계를 사용하여 제조자 균주로부터 제조 될 수 있지만,이 방법은 균주의 큰 컬렉션을 스크리닝 유용한 아니며 박테리오신 발현 수준은 국물 성장 배양 낮은 경우 2,7- 9. 오버레이 분석은 시험 관내에 존재할 수있는 균주간에 경쟁 역학 조사 신속한 방법으로 사용된다. 그렇게하려면, 폐렴 구균 균주는 미리 접종 한천 플레이트 상과 BLP 궤적의 유도에 충분한 로컬 박테리아 농도를 달성하기 위해 증가시킨다. 두 번째 변형은 다음 다음 감도를 테스트 할 수있는 사전 접종 균주에 걸쳐 적용되는 용융 부드러운 한천 솔루션에 접종한다. (억제 활성 무관) BLP 궤적 행위 평가하기 위해 균주 번째 일련의 오버레이 할 수이전에 설명 BlpC 기자 균주를 REE. 이 균주는 폐렴 구균에 의해 분비되는 가장 일반적인 세 BlpC 페로몬에 반응 세 가지 blpH 대립 유전자 중 하나를 포함하도록 구성되었다. 리포터 균주 BlpH 의존 프로모터의 제어하에 있고 자기 자극을 방지 10,11 blpC 유전자에서 삭제를 수행하는 통합의 lacZ 유전자를 가지고있다.
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Protocol
생산자 균주의 1 준비
- 킬 폐렴 구균 균주는 -80 ° C 냉동고 주식에서 5 % 양 혈액 트립 틱 소이 한천 접시에 박테리오신 생산을위한 시험한다.
NOTE : 억제를 판정하는 균주의 초기 성장을위한 혈액 플레이트의 사용은 크게 분석의 재현성을 증가시킨다. 성장 조건은 특정 유기체에 대해 수정해야 할 수도 있지만, 또한, 박테리오신을 생산하는 다른 비 - 폐렴 구균 균주를 사용할 수있다. 우리는 성공적으로 오버레이 분석에서 연쇄상 구균 mitis 및 락토 코커스 락 티스의를 사용하고 있습니다. - 5 % CO 2와 37 ° C에서 밤새 플레이트 (O / N)를 품어.
- 생산자 균주의 배양 후, TSA 25ml를 함유 플레이트에 카탈라제 3,000 4,000 단위를 피펫 팅하여 트립신 콩 한천 (TSA) 판을 제조하고 멸균 유리 비드를 이용하여 용액을 카탈라아제 확산. 약 10 분 아래에 접시를 건조 시키생물 안전 캐비닛.
- 피펫 팁에 박테리아의 가시적 양을 수집합니다. 건조 TSA 플레이트에 피펫 팁을 찔러.
참고 : 하나의 생산 균주 이상은 하나의 TSA 플레이트에 찔 수 있습니다. 결과 후광이 겹치지 않도록 그것은 찢고 밖으로 공간으로 중요합니다.- 가능한 경우, 양성 대조군 및 음성 대조군으로서 오버레이에 사용되는 균주로서 프로듀서 박테리오신 알려진 것을 포함한다.
참고 : 양성 및 음성 컨트롤은 이전에 게시 된 아르 요청 10시 사용할 수 있습니다.
- 가능한 경우, 양성 대조군 및 음성 대조군으로서 오버레이에 사용되는 균주로서 프로듀서 박테리오신 알려진 것을 포함한다.
- 6 시간 동안 5 % CO 2와 37 ° C에 여러 찌르기를 포함하는 TSA 플레이트를 품어.
오버레이 스트레인의 2 만들기 글리세롤 주식
- 오버레이 분석의 일 이전에 (글리세롤의 추가 후 중간 지수 단계로 성장하고 -80 ° C에서 보관 문화) 글리세롤 주식을 준비합니다. 폐렴 구균 STR 5-10 식민지를 접종아인은 0.5 % 효모 추출물 (THY)와 토드 휴잇 매체 감도 또는 페로몬 분비 검사를한다.
참고 : BlpC 유도 기자의 건설 이전에 2를 설명하고 균주의 요청에 따라 사용할 수 있습니다. - 흔들림없이 37 ° C의 물을 욕조에 단단히 밀폐 뚜껑 THY의 5 ㎖의 유리 튜브에 5 ~ 10 식민지를 품어.
- 그들은 0.5 OD에게 0.3의 620에 도달 할 때까지 37 ° C에서 문화를 품다.
참고 :이 사용되는 균주에 따라 약 4-5 시간이 소요됩니다.- 부드럽게 튜브에게 OD를 측정하기 전에 몇 번 반전.
- 실험 당일 수행 될 수 없거나 균주는 글리세롤을 보유하고 나중에 실험을 재개, 향후 여러 번 사용할 경우. 글리세롤 축적량 들어, 20 %의 최종 농도로 배양하여 글리세롤을 추가한다. -80 ° C에서 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브 및 저장소로 나누어지는 문화. 참고 : 샘플의 할 수있다-80 ° C에서 달 tored. 글리세롤 주식을하지 않는 경우, 오버레이 분석을 위해 직접 샘플을 사용합니다.
3 오버레이 분석
- 직전, 응용 프로그램을 오버레이 오버레이 구성 요소를 혼합한다. 15 ML 원뿔 관에서 THY 5 ㎖, 카탈라아제의 3,000 ~ 4,000 U, 그리고 그 중 하나 일 또는 실온에서 해동 된 문화의 글리세롤 주식을 성장시켰다 오버레이 균주 배양액의 200 μl를 추가합니다. 기자 균주를 사용하는 경우, 오버레이 혼합물에 X 갤런의 50 μL (40 ㎎ / ㎖)를 추가합니다. 접시 당 하나의 원뿔 튜브를 사용합니다.
- 이전 용융 TSA의 추가로 실온에서 오버레이 혼합 평형.
- 인큐베이터에서 칼에 찔린 균주 TSA 플레이트를 제거합니다. 전자 레인지에 고체 TSA 녹여 사용할 준비가 될 때까지 55 ° C의 물을 욕조에 보관하십시오. 1.5 % 한천로 용융 TSA 3 ㎖를 추가 혼합물을 오버레이 55 ° C로 냉각.
- 피펫 직전 오버레이 혼합물을 제조하고, 혼합물은 아주 고화 시작신속. 참고 : 오버레이 도금하기 전에 응고되기 시작하면, 그 결과는 해석 할 수없는 것입니다.
- 피펫 팅에 의해 및 5 ㎖의 피펫이 혼합물에 거품을 소개하지 않도록주의 여러 번 아래로 오버레이 혼합물을 섞는다. 천천히 칼에 찔린 TSA 플레이트에 직접 오버레이 혼합물을 피펫. 한천이 굳어 할 수 있도록 몇 분 동안 벤치 탑에있는 플레이트에 보관하십시오.
- 오버레이 혼합물을 배포 할 수있는 판을 돌리지 마십시오,이 오버레이에 찔 문화에서 성장을 끌어.
- 조심스럽게 5 % CO 2 O / N (약 16 ~ 18 시간)을 포함 37 ° C 배양기에 오버레이 TSA 플레이트를 배치합니다.
- 하룻밤 성장 후 번호판을 관찰한다. 판 억제 또는 페로몬 신호가 발생한 지역을 제외하고 오버레이 균주의 성장 불투명 나타납니다. 이들은 각각 찔 변형 주위를 청소 또는 청색의 영역으로 표시됩니다.
참고 : 비록 지표 성과청색 또는 정화 직경 ements은 정량적 평가를 위해 결정될 수있다 직경의 차이는 또한 접시에 찔린 박테리아의 양에 따라 달라질 수있다. 오버레이 분석은 정량적 평가는 신중하게 해석되어야한다, 질적 분석이다. 음성 대조군에 비해 눈에 띄는 개간 활동으로 간주된다.
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Representative Results
오버레이 분석에서 두 가지 결과가 있습니다. 하룻밤 배양 한 후 칼에 찔린 균주의 성장을 할 수 있어야한다. 그림 1A에서 오버레이 변형 박테리오신이 생산되고에 민감하다. 통관의 영역은 칼에 부담을 둘러싼 시각화 할 수 있습니다. 또한, 오버레이 혼합물에 찔 균주의 소용돌이가 가능하며,도 1a에서 볼 수있다. 그림 1B에서 오버레이 변형은 자상을 둘러싼 후광의 부재에 의해 언급 된 바와 같이 분비되는 박테리오신 영향을받지 않는다. 이 찔 균주 박테리오신을 분비하지 않은 것 또한 가능하다. 신호 분석의 경우, 두 개의 서로 다른 결과들이 가능하다. 찔 균주는도 2a에 도시 된 바와 같이 X-GAL의 분해를 통해 본, 오버레이 균주의 히스티딘 키나아제와 상호 작용 페로몬을 분비 할 수있다. 페로몬의 전사를 활성화하지 않는 경우찔 균주 페로몬 분비되지 않는 경우도 2b에 도시 된 바와 같이 리포터 균주 BLP 궤적, 또는 X-GAL의 파괴가 발생하지 않을 것이다.
오버레이 분석에서 BLP 매개 억제 및 내성의 1 외관 그림. (A) P133 균주, 박테리오신 제조자는 TSA 플레이트로 아군과 6 시간 동안 성장시켰다. 균주 P250, 박테리오신 네거티브 균주 오버레이에 접종 하였다. 플레이트는 O / N 배양 후 촬영 하였다. 통관의 영역은 화살표로 표시됩니다. (B) 스트레인 P133은 TSA 플레이트로 아군과 6 시간 동안 배양 하였다. blpA에 틀 이동 돌연변이를 함유하는 변형 (130)는, 오버레이에 접종 하였다. O / N의 배양 후, 플레이트를 촬영했다.
그림 2 페로몬은 분석 신호에 BLP 궤적의 활성화를 매개. (A) 스트레인 P133, BlpC 유형 R6의 secretor은, TSA 플레이트로 아군과 6 시간 동안 배양 하였다. 스트레인 P981, BlpC에서 삭제되는 BlpC 유형 R6 기자, 오버레이에 접종 하였다. 사진은 O / N 배양 후 촬영 하였다. (B) P133은 TSA 플레이트에 타서. 6 시간 동안 배양 한 후, P845, BlpC에서 삭제되는 BlpC 형 P164 기자는 오버레이에 접종 하였다. 사진은 O / N 성장 후 촬영 하였다.
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Discussion
이 오버레이 분석은 박테리오신 생산자 활동의 범위를 결정하고 폐렴 구균 균주 사이에서 발생할 수있는 경쟁적인 상호 작용을 보여주기 위해 빠른 방법이다. 오버레이 분석은 하나의 플레이트에 대한 여러 박테리오신 생산 균주 선별을 위해 사용하도록 구성 될 수있다. 우리는 성공적으로 96 웰 플레이트의 절반에서 SBA 판을 접종 48 핀 복제기를 사용하여이 분석에 큰 부담 모음을 상영했다. 밤새 배양 한 후, 성장 복제기를 사용 리플리케이터의 핀의 접시 한천 표면 피어싱 TSA 플레이트에 전달된다.
란티 바이오 틱은 같은 농도 의존적으로 조절되는 기타 세균 분비하는 항균 펩타이드는 오버레이 방식을 사용 7,12,13 검사 할 수있다. 이 박테리오신 또는 lantibiotic의 정화가 어려운 경우에 특히 유용합니다. 상청액 항균 시험을 할 수 있지만활성은 배양액에서 BLP 유래 박테리오신의 발현은 (데이터는 도시하지 않음) 매우 제한적이거나 존재하지 않는 것이다. 오버레이 분석은 생물 액체에서 재배 할 때 달성되지 않는 높은 밀도로 성장 할 수 있습니다. 고체 배지에서의 성장도 더 밀접하게 인두의 생체 성장 조건을 반영 할 수 있습니다.
오버레이 분석은 또한 특정 시그널링 박테리오신 페로몬 분비 찔 균주의 능력을 검사하기 위해 사용될 수있다. 이것은 페로몬 수용체 단백질을 발현하고있는 페로몬 반응 촉진제의 lacZ 유전자의 상류에 배치된다 리포터 균주의 구축을 요구한다. 찔 균주 오버레이 변형을 저해하지 않는 경우 찔 균주에 의한 페로몬 분비 절상 BLP 궤적 활동 판독로서 특히 유용하다. 오버레이 변형을 억제 할 수 없다는 등의 같은 비 기능적 BLP 궤적 (의 결과가 될 수수송 돌연변이로 변형) 또는 분비 박테리오신 테스트 특정 오버레이 변형에 대한 활성화되지 때문이다. 기자 스트레인 오버레이는 생산자의 궤적이 페로몬의 상향 조절하고 분비 수 있도록 완벽하게 두 구성 요소 시스템 기능 및 BlpA 수송을 가지고 추가 정보를 제공합니다. 이것은 어떤 인코딩 박테리오신도 분비 것을 의미한다.
이 분석에 몇 가지 제한이 적용됩니다. 저해 활성 또는 상이한 균주 페로몬 분비 사이의 비교가 깊게 이루어져야 할 필요가 있으므로 오버레이 분석은 정성 분석이다. 분석의 결과는 오버레이 및 찔 균주의 성장 속도에 크게 의존하기 때문에 다른 균주를 비교했을 때의 성장 속도에 관한 조건이 고려되어야한다. 플레이트 및 오버레이 모두 카탈라아제의 첨가는 2 O 2 생산 폐렴의 H의 억제 효과를 제거하기 위해 중요오버레이 균주의 성장은, 특히 오버레이 카탈라아제 네거티브 유기체를 사용하는 경우. 폐렴 인구 게놈 컨텐츠의 다양성 공지 주어이 분석 함께 볼 어떤 저해 활성이 자동 분석 결실없이 BLP 궤적에 기인 할 수 없다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trypticase Soy Agar with 5% Sheep Blood | Fisher | B21261X | For growth from freezer cultures |
| Catalase | Sigma | C100-500mg | 4,741 Units per plate |
| Todd Hewitt Broth + Yeast Extract (THY) | Fisher | DF0492-17-6 | 30 g of THB, 5 g yeast extract, 1 L ddH2O autoclave |
| Trypticase Soy Broth + Agar plates (TSA) | Fisher | B11768 | 30 g of TS, 15 g agar, 1 L ddH2O autoclave |
| 5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside (X-gal) | Sigma | B4252-50MG | Dissolve in dimethylformamide |
| Petri dishes | Fisher | FB0875712 | |
| Spectrophometer | Measures the OD620 of cultures | ||
| 37 °C water bath | |||
| 37 °C incubator with 5% CO2 | |||
| 15 ml conical tube |
References
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