Introduction
स्ट्रैपटोकोकस निमोनिया, nasopharynx की polymicrobial समुदाय के एक आम उपनिवेशवादी, bacterially उत्पादन रोगाणुरोधी पेप्टाइड्स (बैक्टीरियोसिन्स) के उत्पादन के माध्यम से अन्य pneumococci और निकट से संबंधित प्रजातियों के साथ प्रतिस्पर्धा करने में सक्षम है. तारीख करने के लिए जांच की हर पूरी तरह से अनुक्रम न्यूमोकोकल तनाव बी acteriocin- एल आइक पी eptide ठिकाना, BLP का एक संस्करण है. Pneumococcus द्वारा Bacteriocin उत्पादन दोनों में इन विट्रो के परिणाम में और vivo प्रतियोगिता 1-4 में महत्वपूर्ण होने के लिए प्रदर्शन किया गया है. प्रतियोगी गतिशीलता एक विशिष्ट पेप्टाइड फेरोमोन के जवाब में आत्मीय प्रतिरक्षा प्रोटीन के साथ साथ विविध बैक्टीरियोसिन्स की अभिव्यक्ति से प्रभावित हैं. BLP लोकस की प्रेरण एक पेप्टाइड फेरोमोन, BlpC, सेंसर काइनेज, BlpH को बांधता है, जिसमें एक कोरम संवेदन प्रणाली द्वारा नियंत्रित है, और जिसके परिणामस्वरूप में एक संकेत झरना शुरू की हैBLP ठिकाना 5,6 के प्रतिलेखन. BlpC के चार allelic भिन्नता है कि अपने आत्मीय BlpH 6 के लिए प्रत्येक बाँध. सेल अपनी ही bacteriocin का प्रभाव जीवित रहने के लिए, आत्मीय प्रतिरक्षा प्रोटीन सांकेतिक शब्दों में बदलना है कि जीन bacteriocin जीनों में से प्रत्येक के रूप में एक ही operon पर लिखित हैं. तनाव संरक्षण के लिए आवश्यक विशिष्ट उन्मुक्ति जीन का अभाव है अगर एक प्रतियोगी तनाव, बहिर्जात फेरोमोन के जवाब में BLP ठिकाना upregulate करने में सक्षम नहीं है या अगर हत्या होती है. ट्रांसपोर्टर जटिल, BlpAB स्राव और प्रसंस्करण पेप्टाइड फेरोमोन की और bacteriocin पेप्टाइड्स 2,4 के लिए आवश्यक है. हाल ही में, यह न्यूमोकोकल उपभेदों का एक महत्वपूर्ण अनुपात वे उन्हें असमर्थ फेरोमोन और बैक्टीरियोसिन्स 1,2 छिपाना renders जो blpA जीन में एक संरक्षित उत्परिवर्तन है जिसका अर्थ है "धोखेबाज" हैं कि दिखाया गया है. इन उपभेदों पड़ोसी द्वारा स्रावित बहिर्जात BlpC 2 के लिए प्रतिक्रिया करने में सक्षम हैंप्रतिरक्षा प्रोटीन के उत्पादन के लिए अनुमति उबाऊ उपभेदों.
Supernatants से बैक्टीरियोसिन्स की, कच्चे तेल की तैयारी पवित्रता प्राप्त करने के लिए जैव रासायनिक विधियों चरणों का उपयोग उत्पादक उपभेदों से तैयार किया जा सकता है, इस दृष्टिकोण वियोजन के बड़े संग्रह स्क्रीनिंग के लिए उपयोगी नहीं है और bacteriocin अभिव्यक्ति के स्तर शोरबा हो गई संस्कृतियों में कम है 2,7- 9. ओवरले परख इन विट्रो में मौजूद हो सकता है कि उपभेदों के बीच प्रतिस्पर्धी गतिशीलता की जांच के लिए एक तेजी से रास्ते के रूप में प्रयोग किया जाता है. ऐसा करने के लिए, एक न्यूमोकोकल तनाव पूर्व टीका एक अगर प्लेट पर और BLP लोकस की प्रेरण के लिए पर्याप्त स्थानीय बैक्टीरियल सांद्रता को प्राप्त करने के लिए विकसित करने की अनुमति दी है. एक दूसरे तनाव तो फिर संवेदनशीलता के लिए परीक्षण करने के लिए पूर्व टीका तनाव पर लागू होता है जो एक पिघला हुआ नरम अगर समाधान में टीका है. (निरोधात्मक गतिविधि की स्वतंत्र) BLP लोकस की गतिविधि के लिए मूल्यांकन करने के लिए, उपभेदों वीं की एक श्रृंखला के साथ मढ़ा जा सकता हैपहले से वर्णित BlpC रिपोर्टर उपभेदों REE. इन उपभेदों pneumococci द्वारा स्रावित तीन सबसे आम BlpC फेरोमोन का जवाब है कि तीन अलग blpH alleles में से एक को रोकने के लिए निर्माण किया गया. रिपोर्टर उपभेदों एक BlpH निर्भर प्रमोटर के नियंत्रण में है और आत्म उत्तेजना 10,11 रोकता है blpC जीन में एक विलोपन ले कि एक एकीकृत lacZ जीन है.
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Protocol
निर्माता तनाव के 1. तैयारी
- स्ट्रीक एक न्यूमोकोकल तनाव -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर शेयरों से 5% भेड़ रक्त tryptic सोया अगर प्लेट पर bacteriocin उत्पादन के लिए परीक्षण किया जाना है.
नोट: निषेध के लिए परीक्षण किया जा तनाव के प्रारंभिक विकास के लिए रक्त प्लेटों का उपयोग बहुत परख के reproducibility बढ़ जाती है. विकास की स्थिति एक विशिष्ट जीव के लिए संशोधित करने की आवश्यकता हो सकती है, हालांकि इसके साथ ही, बैक्टीरियोसिन्स उपज कि अन्य गैर न्यूमोकोकल उपभेदों इस्तेमाल किया जा सकता है. हम सफलतापूर्वक ओवरले परख में स्ट्रेप्टोकोकस mitis और Lactococcus lactis का इस्तेमाल किया है. - 5% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात प्लेट (ओ / एन) सेते हैं.
- निर्माता तनाव के ऊष्मायन के बाद, टीएसए के 25 मिलीलीटर युक्त प्लेटों पर Catalase की 3,000 से 4,000 इकाइयों pipetting द्वारा tryptic सोया अगर (टीएसए) प्लेट तैयार करने और बाँझ ग्लास मनकों का उपयोग Catalase समाधान फैल गया. लगभग 10 मिनट के तहत के लिए थाली सूखी चलोएक जैविक सुरक्षा कैबिनेट.
- एक विंदुक टिप पर बैक्टीरिया का एक दृश्य मात्रा लीजिए. सूखे टीएसए थाली में पिपेट टिप वार.
ध्यान दें: एक निर्माता तनाव से अधिक एक ही टीएसए थाली में चाकू मारा जा सकता है. परिणामस्वरूप halos ओवरलैप नहीं है कि तो यह stabs बाहर अंतरिक्ष के लिए महत्वपूर्ण है.- यदि संभव हो तो, एक सकारात्मक नियंत्रण और एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में ओवरले में इस्तेमाल किया जा तनाव के रूप में निर्माता bacteriocin में जाना शामिल है.
नोट: सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण पहले प्रकाशित किया गया है और अनुरोध 10 पर उपलब्ध हैं.
- यदि संभव हो तो, एक सकारात्मक नियंत्रण और एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में ओवरले में इस्तेमाल किया जा तनाव के रूप में निर्माता bacteriocin में जाना शामिल है.
- 6 घंटे के लिए 5% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर कई stabs युक्त टीएसए थाली सेते हैं.
ओवरले तनाव के 2 बनाना ग्लिसरॉल शेयरों
- ओवरले परख के दिन से पहले (ग्लिसरॉल के बाद इसके अलावा मध्य घातीय चरण हो गई और फिर -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत संस्कृतियों) ग्लिसरॉल शेयरों तैयार करें. न्यूमोकोकल Str के 5-10 कालोनियों टीका लगानाऐन 0.5% खमीर निकालने (तेरा) के साथ टोड-हेविट माध्यम में संवेदनशीलता या फेरोमोन स्राव के लिए परीक्षण किया जाना है.
नोट: BlpC inducible संवाददाताओं का निर्माण पहले से 2 वर्णित किया गया है और उपभेदों अनुरोध पर उपलब्ध हैं. - झटकों के बिना एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में कसकर बंद lids के साथ तेरा 5 मिलीलीटर के साथ ग्लास ट्यूब में 5-10 कालोनियों सेते हैं.
- वे 0.5 के लिए एक आयुध डिपो 0.3 से 620 तक पहुंचने तक 37 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृतियों सेते हैं.
नोट: यह प्रयोग किया जाता तनाव के आधार पर लगभग 4-5 घंटे का समय लगेगा.- धीरे ट्यूब आयुध डिपो को मापने के लिए पहले एक बार कुछ पलटना.
- प्रयोग एक ही दिन प्रदर्शन नहीं किया जा सकता या तनाव ग्लिसरॉल शेयरों बनाने और एक बाद की तारीख में प्रयोग फिर से शुरू, भविष्य में कई बार इस्तेमाल किया जाएगा. ग्लिसरॉल शेयरों के लिए, 20% की एक अंतिम एकाग्रता संस्कृतियों को ग्लिसरॉल जोड़ें. -80 डिग्री सेल्सियस पर 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब और दुकान में विभाज्य संस्कृतियों. नोट: नमूने है हो सकता है-80 डिग्री सेल्सियस पर महीनों के लिए tored. ग्लिसरॉल शेयरों बनाने यदि नहीं, ओवरले परख के लिए सीधे नमूने का उपयोग करें.
3 ओवरले परख
- बस से पहले, आवेदन ओवरले ओवरले घटकों मिश्रण करने के लिए. एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में, तेरा की 5 मिलीलीटर, Catalase के 3,000-4,000 यू, और या तो उस दिन या कमरे के तापमान पर thawed किया गया था कि संस्कृति की एक ग्लिसरॉल स्टॉक हो गया था कि ओवरले तनाव शोरबा संस्कृति की 200 μl जोड़ें. संवाददाता तनाव का उपयोग करते हैं, ओवरले मिश्रण करने के लिए एक्स लड़की की 50 μl (40 मिलीग्राम / एमएल) जोड़ने. प्लेट प्रति एक शंक्वाकार ट्यूब का उपयोग करें.
- पूर्व पिघला हुआ टीएसए के अलावा करने के लिए कमरे के तापमान पर ओवरले मिश्रण संतुलित करना.
- इनक्यूबेटर से वार तनाव के साथ टीएसए थाली निकालें. माइक्रोवेव में ठोस टीएसए पिघला और उपयोग करने के लिए तैयार है जब तक 55 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में रहते हैं. 1.5% अगर साथ पिघला हुआ टीएसए के 3 मिलीलीटर जोड़ें मिश्रण उपरिशायी 55 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा.
- Pipetting से पहले तुरंत ओवरले मिश्रण तैयार करें, मिश्रण बहुत जमना शुरू हो जाएगाजल्दी. नोट: ओवरले चढ़ाना पहले जमना शुरू होता है, तो परिणाम uninterpretable किया जाएगा.
- ऊपर pipetting द्वारा और एक 5 मिलीलीटर pipet मिश्रण में बुलबुले परिचय नहीं सावधान किया जा रहा है के साथ कई बार नीचे ओवरले मिश्रण मिलाएं. धीरे धीरे वार टीएसए थाली पर सीधे ओवरले मिश्रण पिपेट. अगर कड़ा करने की अनुमति कुछ मिनट के लिए benchtop पर थाली रखें.
- ओवरले मिश्रण वितरित करने के लिए थाली बारी बारी मत करो, इस ओवरले में छुरा घोंपा संस्कृति से विकास करना होगा.
- ध्यान से 5% सीओ 2 हे / एन (लगभग 16-18 घंटा) से युक्त 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में ओवरले के साथ टीएसए प्लेट रखें.
- रातोंरात वृद्धि के बाद प्लेटों का निरीक्षण करें. प्लेटों निषेध या फेरोमोन संकेत आ गई है जहां क्षेत्रों में छोड़कर ओवरले तनाव के विकास से अपारदर्शी दिखाई देनी चाहिए. ये क्रमश: चाकू मारा तनाव के आसपास स्पष्ट या नीले या तो क्षेत्र के रूप में दिखाई देगा.
नोट: हालांकि measurनीले या समाशोधन के व्यास का ements, मात्रात्मक मूल्यांकन के लिए निर्धारित किया जा सकता व्यास में मतभेद भी थाली में छुरा घोंपा गया था कि बैक्टीरिया की मात्रा के आधार पर भिन्न कर सकते हैं. ओवरले परख किसी भी मात्रात्मक आकलन सावधानी के साथ व्याख्या की जानी चाहिए, एक गुणात्मक परख है. नकारात्मक नियंत्रण की तुलना में किसी भी दृश्य समाशोधन गतिविधि के रूप में माना जाता है.
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Representative Results
ओवरले परख में दो संभावित परिणामों रहे हैं. यह रातोंरात ऊष्मायन के बाद चाकू मारा तनाव के विकास को देखने के लिए संभव होना चाहिए. चित्रा 1 ए में, ओवरले तनाव बैक्टीरियोसिन्स उत्पादन किया जा रहा करने के लिए संवेदनशील है. निकासी के एक क्षेत्र वार तनाव आसपास के देखे जा सकते हैं. साथ ही, ओवरले मिश्रण में छुरा घोंपा तनाव का घूमता संभव है और चित्रा 1 ए में देखा जा सकता है. चित्रा 1 बी में, ओवरले तनाव वार आसपास के एक प्रभामंडल की अनुपस्थिति द्वारा नोट के रूप में स्रावित किया जा रहा बैक्टीरियोसिन्स के लिए प्रतिरक्षा है. यह वार तनाव बैक्टीरियोसिन्स स्रावित नहीं है कि यह भी संभव है. संकेत परख के लिए, दो अलग परिणाम संभव हैं. वार तनाव चित्रा 2A में दिखाया गया है एक्स लड़की के टूटने के माध्यम के रूप में देखा, ओवरले तनाव की हिस्टडीन काइनेज के साथ सूचना का आदान कि फेरोमोन स्रावित करने में सक्षम है. फेरोमोन के प्रतिलेखन को सक्रिय नहीं करता हैवार तनाव फेरोमोन छिपाना नहीं करता है चित्रा 2 बी के रूप में दिखाया संवाददाता तनाव में BLP ठिकाना, या, एक्स लड़की का टूटना घटित नहीं होगा.
एक उपरिशायी परख में BLP मध्यस्थता निषेध और प्रतिरक्षा की 1. रूप चित्रा. (ए) तनाव P133, एक bacteriocin निर्माता एक टीएसए थाली में नुकीला और 6 घंटे के लिए विकसित करने के लिए अनुमति दी गई थी. तनाव P250, एक bacteriocin नकारात्मक तनाव, ओवरले में inoculated किया गया था. प्लेट्स हे / एन ऊष्मायन के बाद फोटो खींच रहे थे. निकासी के एक क्षेत्र तीर द्वारा संकेत दिया है. (बी) तनाव P133 एक टीएसए थाली में नुकीला और 6 घंटे के लिए incubated था. BlpA में एक frameshift उत्परिवर्तन युक्त तनाव 130, ओवरले में inoculated किया गया था. ओ / एन ऊष्मायन के बाद, प्लेटें फोटो खींच रहे थे.
चित्रा 2 Pheromone परख संकेत में BLP लोकस की सक्रियता मध्यस्थता. (ए) तनाव P133, एक BlpC प्रकार R6 secretor, एक टीएसए थाली में नुकीला और 6 घंटे के लिए incubated था. तनाव P981, BlpC में एक विलोपन के साथ एक BlpC प्रकार R6 संवाददाता, ओवरले में inoculated किया गया था. फोटो ओ / एन ऊष्मायन के बाद लिया गया. (बी) P133 एक टीएसए थाली में नुकीला था. 6 घंटे के लिए ऊष्मायन के बाद, P845, BlpC में एक विलोपन के साथ एक BlpC प्रकार P164 संवाददाता, ओवरले में inoculated किया गया था. फोटो ओ / एन वृद्धि के बाद लिया गया.
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Discussion
इस उपरिशायी परख bacteriocin उत्पादकों के लिए गतिविधि की सीमा निर्धारित करने के लिए और न्यूमोकोकल उपभेदों के बीच उत्पन्न हो सकने वाली प्रतिस्पर्धी बातचीत प्रदर्शित करने के लिए एक तेजी से रास्ता है. ओवरले परख एक ही थाली पर bacteriocin उत्पादन के लिए कई उपभेदों स्क्रीनिंग के लिए उपयोग करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता. हम सफलतापूर्वक एक 96 अच्छी तरह से थाली में से एक आधे से एसबीए प्लेटें टीका लगाना एक 48 पिन प्रतिलिपिकार का उपयोग करके यह परख के साथ बड़े तनाव संग्रह जांच की है. रातोंरात ऊष्मायन के बाद, विकास प्रतिलिपिकार का उपयोग और प्रतिलिपिकार की पिन के साथ थाली की अगर सतह भेदी टीएसए प्लेट को सौंप दिया है.
Lantibiotics तरह एक घनत्व निर्भर ढंग से नियंत्रित कर रहे हैं कि अन्य bacterially स्रावित रोगाणुरोधी पेप्टाइड्स भी ओवरले तकनीक 7,12,13 का उपयोग कर जांच की जा सकती. यह एक bacteriocin या lantibiotic की शुद्धि के लिए मुश्किल है जब विशेष रूप से उपयोगी है. Supernatants रोगाणुरोधी के लिए परीक्षण किया जा सकता हैगतिविधि, शोरबा में BLP व्युत्पन्न बैक्टीरियोसिन्स की अभिव्यक्ति (नहीं दिखाया डेटा) बहुत सीमित या नगण्य है. ओवरले परख जीवों तरल में बड़े हो रहे हैं जब हासिल नहीं है जो एक उच्च घनत्व के विकास के लिए अनुमति देता है. एक ठोस माध्यम पर विकास भी अधिक बारीकी से nasopharynx के vivo विकास की स्थिति को प्रतिबिंबित हो सकता है.
ओवरले परख भी bacteriocin विशिष्ट संकेत फेरोमोन छिपाना वार तनाव की क्षमता की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. यह फेरोमोन रिसेप्टर प्रोटीन व्यक्त किया और जिसमें एक फेरोमोन उत्तरदायी प्रमोटर lacZ जीन की नदी के ऊपर रखा गया है जो एक संवाददाता तनाव के निर्माण की आवश्यकता है. वार तनाव ओवरले तनाव को बाधित नहीं करता है तो एक चाकू मारा तनाव से फेरोमोन स्राव की प्रशंसा BLP ठिकाना गतिविधि का एक readout के रूप में विशेष रूप से उपयोगी है. ओवरले तनाव को बाधित करने में असमर्थता एक ऐसी के रूप में एक गैर कार्यात्मक BLP ठिकाना (का नतीजा हो सकता हैएक ट्रांसपोर्टर उत्परिवर्तन के साथ तनाव) या स्रावित बैक्टीरियोसिन्स परीक्षण विशेष ओवरले तनाव के खिलाफ सक्रिय नहीं हैं. संवाददाता तनाव ओवरले निर्माता में ठिकाना फेरोमोन के upregulation और स्राव की अनुमति के लिए एक पूरी तरह से दो घटक प्रणाली कार्यात्मक और BlpA ट्रांसपोर्टर है कि अतिरिक्त जानकारी प्रदान करता है. यह किसी भी इनकोडिंग बैक्टीरियोसिन्स भी स्रावित होते हैं कि निकलता है.
इस परख के लिए कुछ सीमाएं हैं. निरोधात्मक गतिविधि या विभिन्न प्रकारों के फेरोमोन स्राव के बीच तुलना सावधानी से किया जाना है ताकि उपरिशायी परख, एक गुणात्मक परख है. परख का परिणाम ओवरले और चाकू मारा उपभेदों की विकास दर पर काफी निर्भर करता है, क्योंकि विभिन्न प्रकारों की तुलना जब विकास दर और शर्तों पर विचार किया जाना चाहिए. थाली और ओवरले दोनों को Catalase के अलावा पर 2 2 हे उत्पादन न्यूमोकोकल एच के निरोधात्मक प्रभाव को दूर करने के क्रम में महत्वपूर्ण हैओवरले तनाव का विकास, विशेष रूप से ओवरले में Catalase नकारात्मक जीव का उपयोग करते समय. न्यूमोकोकल जनसंख्या में जीनोमिक सामग्री के ज्ञात विविधता को देखते हुए, इस परख के साथ देखा किसी भी निरोधात्मक गतिविधि स्वतः deletional विश्लेषण के बिना BLP ठिकाना नहीं ठहराया जा सकता.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trypticase Soy Agar with 5% Sheep Blood | Fisher | B21261X | For growth from freezer cultures |
| Catalase | Sigma | C100-500mg | 4,741 Units per plate |
| Todd Hewitt Broth + Yeast Extract (THY) | Fisher | DF0492-17-6 | 30 g of THB, 5 g yeast extract, 1 L ddH2O autoclave |
| Trypticase Soy Broth + Agar plates (TSA) | Fisher | B11768 | 30 g of TS, 15 g agar, 1 L ddH2O autoclave |
| 5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside (X-gal) | Sigma | B4252-50MG | Dissolve in dimethylformamide |
| Petri dishes | Fisher | FB0875712 | |
| Spectrophometer | Measures the OD620 of cultures | ||
| 37 °C water bath | |||
| 37 °C incubator with 5% CO2 | |||
| 15 ml conical tube |
References
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