Introduction
Streptococcus pneumoniae, nazofarenks polimikrobiyaldir eden ortak bir şekilde koloni, bakteriyel olarak üretilmiş antimikrobiyal peptitler (bakteriosinler) üretimi aracılığıyla diğer pneumococci ve yakından ilişkili türleri ile rekabet edebilmektedir. Bugüne kadar incelenen her tam sıralandı pnömokok suşu b acteriocin- l ike p peptit odağı blp bir sürümünü içerir. Pnömokok bakteriyosin üretimi, hem in vitro ve in vivo sonuç 1-4 rekabet önemli olduğu gösterilmiştir. Rekabetçi dinamikleri, spesifik peptit feromon tepki olarak aynı kökenli bağışıklık proteinlerle birlikte çeşitli bakteriyosinlerin ekspresyonu ile etkilenmektedir. Blp lokusunun indüksiyonu bir peptit feromon, BlpC, sensör kinaz BlpH bağlanan olan bir çekirdek algılama sistemi ile kontrol ve sonuçlanan bir sinyal akışını başlatır edilirblp lokus 5,6 transkripsiyonu. BlpC dört alelik varyasyonlar vardır ki, kendi doğasındaki BlpH 6 her bağlanmaktadır. Hücre, kendi bakteriyosin etkilerini hayatta kalabilmesi için ortak kökenli bağışıklık proteinleri kodlayan genler bakteriyosin genlerin her biri ile aynı operonunun transkribe edilmektedir. Soy korunması için gerekli olan özel gen bağışıklık yetersiz kalması durumunda, bir rakip soyu dışsal feromon tepki olarak blp lokusu yukarı doğru düzenleme mümkün olup olmadığını ya Öldürme oluşur. Taşıyıcı kompleksi, BlpAB salgısı ile işleme peptit feromon ve bakteriyosin peptidler 2,4 için gereklidir. Son zamanlarda, bu pnömokok suşları önemli bir bölümünün de bir durumdur bu feromonu ve bakteriyosin 1,2 salgılamasına hale blpA geninde bir mutasyon korunmuş olması, yani "dolandırıcı" olduğu gösterilmiştir. Bu suşlar kişnemek tarafından salgılanan eksojen BlpC 2 yanıt edebiliyoruzbağışıklık proteinlerin üretimi için izin sıkıcı suşları.
Süpernatanlarından bakteriyosinlerin, ham preparatlar saflık elde etmek için biyokimyasal yöntemler kullanılarak adımları Üretici türlerde hazırlanabilir, ancak, bu yaklaşım, büyük izolat koleksiyonlarının taranmasında yararlı değildir ve bakteriyosin ekspresyon seviyesinin suyu büyüyen kültürlerden düşükse 2,7- 9. Bindirme deney in vitro olarak mevcut olabilir suşları arasındaki rekabet dinamiğini incelemek için hızlı bir yöntem olarak kullanılmaktadır. Bunu yapmak için, bir pnömokok soyu önceden aşılanmış agar plaka üzerine ve blp lokusunun uyarılması için yeterli lokal konsantrasyonları elde etmek için bakteriyel büyümeye izin verilir. Ikinci bir soy daha sonra hassasiyeti test etmek için önceden aşılanmış soyu üzerine uygulandığında, erimiş bir yumuşak agar çözeltisi içine aşılanır. (Inhibe edici aktivitesi bağımsız olarak) blp lokusunun değerlendirmek aktivitesi için, suşlar th bir dizi ile kaplanabilirDaha önce tarif BlpC haberci soylarını ree. Bu suşlar, pnömokok tarafından salgılanan en yaygın üç BlpC feromonlar yanıt üç farklı blpH allellerinden biri içeren yapılmıştır. Haberci soylarının bir BlpH bağımlı promotörün kontrolü altındadır ve kendini uyarma 10,11 engeller blpC geninde bir delesyon yerine entegre bir lacZ genini sahiptir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Yapımcı Genleme 1. Hazırlık
- Şerit, bir pnömokok kökenli soyu -80 ° C dondurucu stoktan% 5 koyun kanı triptik soya agar plakası üzerine bakteriyosin üretimi için test edilecek.
Not: inhibisyonu için test edilecek olan soyun ilk büyüme kan plakaların kullanımı büyük ölçüde tahlilin tekrarlanabilirliğini arttırır. Büyüme koşulları, belirli bir organizmanın değiştirilmesi gerekebilir, ancak ek olarak, bakteriyosin üreten diğer non-pnömokok suşları kullanılabilir. Biz başarıyla yayma deneyi Streptococcus mitis ve Lactococcus lactis kullandık. - % 5 CO2 ile 37 ° C 'de gece boyunca plaka (O / N) inkübe edin.
- Üretici soyunun inkübasyondan sonra, TSA 25 ml ihtiva eden plakalar üzerine katalaz 3000 ila 4000 birimleri pipetleme triptik soya agar (TSA) plaka hazırlanması yapılmış ve steril cam boncuklar kullanılarak katalaz çözeltisi yayıldı. Yaklaşık 10 dakika altında plaka kurumasını bekleyinbiyolojik güvenlik kabini.
- Bir pipet üzerine bakteri görünür bir miktar toplayın. Kurutulmuş TSA plakasına pipet bıçakla.
NOT: Bir üretici suş daha fazlası tek bir TSA plakaya bıçakladı edilebilir. Oluşan haleler örtüşmeyen böylece bıçaklandığı uzayda önemlidir.- Mümkünse, bir pozitif kontrol ve bir negatif kontrol olarak, kaplamayla kullanılacak soyu gibi bir üretici bakteriyosin bilinen maddeleri içerir.
NOT: Pozitif ve negatif kontroller daha önce yayınlanmış ve istek 10 üzerine mevcuttur.
- Mümkünse, bir pozitif kontrol ve bir negatif kontrol olarak, kaplamayla kullanılacak soyu gibi bir üretici bakteriyosin bilinen maddeleri içerir.
- 6 saat boyunca% 5 CO2 ile 37 ° C 'de birden fazla saplamanız içeren TSA plaka inkübe edin.
Bindirme Genleme 2. Yapımı Gliserol Stokları
- Yayma deneyi bir gün önce (gliserol ilave edildikten sonra orta üslü faza kadar yetiştirilir ve daha sonra -80 ° C'de saklandı kültürler), gliserol stokları hazırlayın. Pnömokok str 5-10 koloni aşılamakain% 0.5 maya ekstraktı (THY) Todd-Hewitt ortamda hassasiyet veya feromon salgılama açısından test edilmelidir.
NOT: BlpC uyarılabilir gazetecilere İnşaatı daha önce 2 tarif edilmiştir ve suşları istek üzerine mevcuttur. - Çalkalamadan 37 ° C su banyosu içinde sıkıca kapalı kapak THY 5 ml cam tüpler içinde 5-10 koloniler inkübe edin.
- Bunlar, bir 0.5, 0.3 OD 620 gelene kadar, 37 ° C kültürleri inkübe edin.
NOT: Bu, kullanılan gerginlik bağlı olarak yaklaşık 4-5 saat sürer.- Yavaşça tüpü OD ölçme önce bir kaç kez ters çevirin.
- Deneme aynı gün yapılamaz veya zorlanma gliserol stoğu yapmak ve daha sonraki bir tarihte deney devam, gelecekte birden çok kez kullanılabilir edilecektir. Gliserol stokları için,% 20 bir son konsantrasyona kadar kültürler gliserol ekleyin. -80 ° C'de 1.5 mL mikrosantrifüj tüpleri ve mağaza içine kısım kültürleri. NOT: Örnekler s olabilir-80 ° C'de ay boyunca yırtılmaktadır. Gliserol stokları yapmıyor ise, yayma deneyi doğrudan örnekleri kullanabilirsiniz.
3. Kaplama Testi
- Hemen önce, uygulamayı bindirme bindirme bileşenleri karıştırmak için. 15 ml konik bir tüp içinde 5 ml THY, katalaz 3,000-4,000 U ve ya hemen aynı günde ya da oda sıcaklığında eritildi, kültür, bir gliserol stokları yetiştirildi katlamalı soy çorba kültürü 200 ul ilave edin. Raportör suşu kullanılarak, kaplama karışımına, X-gal ve 50 ul (40 mg / ml) ilave edilmektedir. Plaka başına bir konik bir tüp içinde kullanın.
- Önce erimiş TSA ilave edilmeden önce oda sıcaklığında katlamalı karışımı dengelenmesi.
- Inkübatör bıçaklanarak zorlanma ile TSA plakasını sökün. Mikrodalga katı TSA eritin ve kullanmaya hazır olana kadar 55 ° C su banyosunda tutmak. % 1.5 agar erimiş TSA 3 ml ekleyin karışımı katlamalı 55 ° C'ye kadar soğutuldu.
- Pipetlemeden önce hemen bindirme karışım hazırlayın, karışım çok katılaşmaya başlayacaktırhızlı. NOT: bindirme kaplama önce katılaşmaya başlar, sonuçlar uninterpretable olacaktır.
- Pipetleme ve 5 ml'lik pipet karışımın içine kabarcıkları tanıtmak için dikkatli olmak ile birkaç kez aşağı bindirme karışımı karıştırın. Yavaşça bıçaklayarak TSA plakasına doğrudan bindirme karışımı pipetle. Agar sertleşmesine izin birkaç dakika için masa üstü plaka tutun.
- Bindirme karışımı dağıtmak için plakasını döndürmek etmeyin, bu bindirmenin içine bıçakladı kültüründen büyüme çeker.
- Dikkatle% 5 CO 2 O / N (yaklaşık 16-18 saat) içeren 37 ° C inkübatör içine kalıbı ile TSA plakasını yerleştirin.
- Gecede büyümeden sonra plakaları gözlemleyin. Plakalar inhibisyon veya feromon sinyal oluştu alanlar haricinde bindirme suşu büyüme opak görünmelidir. Bunlar sırasıyla, bıçaklanarak zorlanma çevresinde net ya da mavi bölgeler olarak görünecektir.
NOT: Her ne kadar kuvmavi veya açıklığın çapının enlemeleri, niceliksel değerlendirilmesi için belirlenebilir çapı farklılıklar da plakasına býçaklanmýţ bakteri miktarına bağlı olarak değişebilir. Bindirme tahlil herhangi bir nicel değerlendirme dikkatle yorumlanmalıdır gereken, kalitatif bir testtir. Negatif kontrol ile karşılaştırıldığında, herhangi bir görünür temizleme aktivite olarak kabul edilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Yayma deneyi iki olası sonuç vardır. Gece boyunca inkübasyondan sonra bıçakladı suşunun büyümesini görmek mümkün olmalıdır. Şekil 1A, üst tabaka gerilme Bakteriyosinler üretilen duyarlıdır. Atılımının bir bölge bıçakladı gerginlik çevredeki görülebilir. Buna ek olarak, kaplama karışımı içine bıçakladı soyun dönen mümkündür ve Şekil 1A 'da görülebilir. Şekil 1B, üst tabaka gerilme bıçak çevreleyen bir halo olmaması ile belirtildiği gibi salgılanan bakteriyosinlerin için etkilenmez. Bu suş bıçaklayarak bakteriyosinler salgılayan olmadığı da mümkündür. Bir sinyal gönderme deneyinde, iki farklı sonuçlar mümkündür. Bıçaklanarak suşu Şekil 2A'da gösterildiği gibi, X-gal ve parçalanma ile görüldüğü gibi, kaplama soyunun histidin kinaz ile etkileşen feromon salgılaması edebilmektedir. Feromon transkripsiyonunu aktif hale etmezsebıçaklayarak suşu feromon salgılamayan halinde Şekil 2B'de gösterildiği gibi raportör suşunda blp lokus ya da X-gal dökümü meydana gelmez.
Bir bindirme tahlilde blp aracılı inhibisyonu ve bağışıklığın 1. Görünüm Şekil. (A) Gerilme P133, bakteriyosin üretici TSA plakasına tutturuldu ve 6 saat boyunca büyümeye bırakıldı. Gerilme P250, bakteriyosin negatif soyu, kaplama içine aşılandı. Plakalar göre O / N kuluçkalamadan sonra fotoğraflandı. Bir klirens bölgesi ok ile belirtilmiştir. (B) Gerilme P133 TSA plakasına tutturuldu ve 6 saat süreyle inkübe edildi. BlpA bir çerçeve kayması mutasyonuna içeren streyn 130, kaplama içine aşılandı. O / N kuluçka döneminden sonra levhalar fotoğraflandı.
Şekil 2. Feromon tahlil sinyalizasyon içinde blp odağının aktivasyonu aracılı. (A) Gerilme P133, bir BlpC tipi R6 ifrazat, TSA plakasına tutturuldu ve 6 saat süreyle inkübe edildi. Gerilme P981, BlpC bir delesyonu ile bir BlpC tip raportör R6, kaplama içine aşılandı. Fotoğraf O / N inkübasyon sonrasında alındı. (B) P133 TSA plakaya çivili edildi. 6 saat kuluçkalamadan sonra, P845, BlpC bir delesyonu ile bir BlpC tipi P164 raportör, kaplama içine aşılandı. Fotoğraf O / N büyümeden sonra alındı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu bindirme tahlil bakteriyosin üreticileri için faaliyet alanını belirlemek ve pnömokok suşları arasında oluşabilecek rekabet etkileşimleri göstermek için hızlı bir yoldur. Bindirme deney, tek bir plaka üzerinde birden fazla bakteriyosin üretimi suşları taranması için kullanmak üzere adapte edilebilir. Başarıyla, 96 oyuklu bir plakanın yarısını SBA plakalarının aşılanması için bir 48 pimli çoğaltıcı kullanarak, bu deneyde büyük gerilme koleksiyon gösterildi. Gece boyunca inkübasyondan sonra, büyüme replikatörü kullanılarak ve çoğalıcı pimleri ile plakanın agar yüzeyini delerek TSA plakasına aktarılmıştır.
Lantibiyotiklerin gibi bir yoğunluğa bağlı bir şekilde düzenlenmiş diğer bakteriyel olarak salgılanan antimikrobiyal peptitler de üst tabaka tekniği 7,12,13 kullanılarak incelenebilir. Bu, bir bakteriyosin veya lantibiyotik saflaştırılması zor olduğunda özellikle yararlıdır. Süpernatanlar antimikrobik için test edilebilir rağmenaktivitesi, suyu blp türetilmiş bakteriyosinlerin ekspresyonu (veriler gösterilmemiştir) çok sınırlı ya da hiç yoktur. Bindirme tahlil organizmalar sıvı yetiştirilen zaman elde olmayan daha yüksek bir yoğunluğa büyüme sağlar. Katı ortam üzerinde büyüme, daha yakından nazofarenks in vivo büyüme koşullarının yansıtıyor olabilir.
Bindirme analiz ayrıca Bakteriyosin özel sinyalleme feromon salgılaması için bıçakladı soyunun yeteneğini incelemek için kullanılabilir. Bu feromon reseptör proteini eksprese eden ve burada bir feromon tepki yükseltici, lacZ geninin üst akışına yerleştirildiği bir raportör suşunun inşa edilmesini gerektirir. Bıçakladı soy katlamalı suşu inhibe etmez durumunda bıçaklanarak suşu tarafından feromon salgılanmasının Takdir blp odağı aktivitesinin bir okuma olarak özellikle yararlıdır. Katlamalı suşu inhibe etmek için bir yetersizlik olarak fonksiyonel olmayan bir blp yerinin (sonucu olabilirBir taşıyıcı mutasyona sahip suş) veya salgılanan Bakteriyosinler, test edilen özel katlamalı türüne karşı aktif değildir, çünkü. Haberci soyu bindirme üreticisi odağı feromon upregülasyonu ve salgılanması için izin tam iki bileşenli sistemi fonksiyonel ve BlpA transporter olduğu ek bilgi sağlar. Bu, herhangi bir kodlanmış bakteriosinler da salgılanan ifade eder.
Bu deneyde bazı sınırlamalar vardır. Inhibe edici aktivite veya farklı suşlar arasında feromon salgılanması arasındaki karşılaştırmalar dikkatli bir şekilde yapılması gereken çok kalıbı deneyi, niteliksel bir deneyidir. Testin sonucu bindirme ve bıçakladı suşları büyüme hızına dayanır çünkü farklı suşları karşılaştırırken büyüme oranları ve koşulları dikkate alınmalıdır. Plaka ve bir kaplama her iki katalaz ilavesi ile 2 O 2 üretimi pnömokok H inhibitör etkisini kaldırmak için önemlidirbindirme zorlanma büyüme, özellikle bindirme katalaz negatif organizma kullanırken. Pnömokok nüfus genomik içeriğin bilinen çeşitliliği göz önüne alındığında, bu testte görülen herhangi bir engelleyici aktivitesi otomatik delesyonel analiz olmadan blp mahaline isnat edilemez.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trypticase Soy Agar with 5% Sheep Blood | Fisher | B21261X | For growth from freezer cultures |
| Catalase | Sigma | C100-500mg | 4,741 Units per plate |
| Todd Hewitt Broth + Yeast Extract (THY) | Fisher | DF0492-17-6 | 30 g of THB, 5 g yeast extract, 1 L ddH2O autoclave |
| Trypticase Soy Broth + Agar plates (TSA) | Fisher | B11768 | 30 g of TS, 15 g agar, 1 L ddH2O autoclave |
| 5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside (X-gal) | Sigma | B4252-50MG | Dissolve in dimethylformamide |
| Petri dishes | Fisher | FB0875712 | |
| Spectrophometer | Measures the OD620 of cultures | ||
| 37 °C water bath | |||
| 37 °C incubator with 5% CO2 | |||
| 15 ml conical tube |
References
- Dawid, S., Roche, A. M., Weiser, J. N. The blp bacteriocins of Streptococcus pneumoniae mediate intraspecies competition both in vitro and in vivo. Infect Immun. 75 (1), 443-451 (2007).
- Sawa, N., et al. Isolation and characterization of enterocin W, a novel two-peptide lantibiotic produced by Enterococcus faecalis NKR-4-1. Appl Environ Microbiol. 78 (3), 900-903 (2012).
- Kochan, T. J., Dawid, S. The HtrA protease of Streptococcus pneumoniae controls density-dependent stimulation of the bacteriocin blp locus via disruption of pheromone secretion. J Bacteriol. 195 (7), 1561-1572 (2013).
- Lux, T., Nuhn, M., Hakenbeck, R., Reichmann, P. Diversity of bacteriocins and activity spectrum in Streptococcus pneumoniae. J Bacteriol. 189 (21), 7741-7751 (2007).
- Reichmann, P., Hakenbeck, R. Allelic variation in a peptide-inducible two-component system of Streptococcus pneumoniae. FEMS Microbiol Lett. 190 (2), 231-236 (2000).
- Saizieu, A., et al. Microarray-based identification of a novel Streptococcus pneumoniae regulon controlled by an autoinduced peptide. J Bacteriol. 182 (17), 4696-4703 (2000).
- Barbour, A., Philip, K., Muniandy, S. Enhanced production, purification, characterization and mechanism of action of salivaricin 9 lantibiotic produced by Streptococcus salivarius NU10. PLoS One. 8 (10), 77751 (2013).
- Wladyka, B., et al. Isolation, biochemical characterization, and cloning of a bacteriocin from the poultry-associated Staphylococcus aureus strain CH-91. Appl Microbiol Biotechnol. 97 (16), 7229-7239 (2013).
- Shea, E. F., et al. Bactofencin a, a new type of cationic bacteriocin with unusual immunity. 4 (6), 00498-00413 (2013).
- Son, M. R., et al. Conserved mutations in the pneumococcal bacteriocin transporter gene, blpA, result in a complex population consisting of producers and cheaters. MBio. 2 (5), (2011).
- Kochan, T. J., Dawid, S. The HtrA protease of Streptococcus pneumoniae controls density-dependent stimulation of the bacteriocin blp locus via disruption of pheromone secretion. J Bacteriol. 195, 1561-1572 (2013).
- Widdick, D. A., et al. Cloning and engineering of the cinnamycin biosynthetic gene cluster from Streptomyces cinnamoneus cinnamoneus DSM 40005. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (7), 4316-4321 (2003).
- Begley, M., Cotter, P. D., Hill, C., Ross, R. P. Identification of a novel two-peptide lantibiotic, lichenicidin, following rational genome mining for LanM proteins. Appl Environ Microbiol. 75 (17), 5451-5460 (2009).
