Introduction
Пневмококк, общая колонизатор полимикробной сообщества носоглотки, способен конкурировать с другими пневмококков и близкородственных видов путем производства бактериально производства антимикробных пептидов (Бактериоцины). Каждый полностью секвенировали пневмококковой штамм на сегодняшний момент содержит версию б acteriocin- л Айк р eptide локуса, BLP. Бактериоцин производство по пневмококка была продемонстрирована быть важно в исходе как в пробирке и в естественных условиях конкуренции 1-4. Конкурентные динамика под влиянием экспрессии различных бактериоцинов наряду с родственными белками иммунитета в ответ на конкретный пептидной феромона. Индукция BLP локуса контролируется кворума системы зондирования, в котором пептид феромон, BlpC, связывается с киназы датчика, BlpH, и инициирует сигнальный каскад, что приводит ктранскрипция BLP локуса 5,6. Существуют четыре аллельные вариации BlpC, что каждый связываются с родственным BlpH 6. Для клеток, чтобы выжить эффекты собственной бактериоцина, гены, которые кодируют белки, родственные иммунитета транскрибируются на той же оперона в качестве каждого из генов бактериоциновых. Уничтожение происходит, если штамм конкурент не может положительно регулировать в BLP локус в ответ на экзогенный феромона, или, если штамм не имеет конкретный ген иммунитета, необходимого для защиты. Транспортер комплекс, BlpAB требуется для секреции и обработки пептидного феромона и бактериоцина пептидов 2,4. Недавно было показано, что значительная доля пневмококковых штаммов "мошенники", то есть они имеют сохраняющуюся мутацию в гене blpA что делает их не в состоянии выделять феромоны и бактериоцинами 1,2. Эти штаммы способны реагировать на внешнее BlpC 2 секретируется ржутрасточные штаммы, позволяющие для производства иммунитета белков.
Хотя, неочищенные препараты бактериоцинов из супернатантов могут быть получены из штаммов-продуцентов с помощью биохимических методов шаги, чтобы достичь чистоты, этот подход не является полезным для скрининга больших коллекции штаммов, и если уровень экспрессии бактериоцина низка в бульоне выращивают культур 2,7- 9. Наложение анализ используют в качестве быстрого способа исследовать динамику конкуренции между штаммами, которые могут существовать в пробирке. Чтобы сделать это, пневмококковой деформации предварительно высевали на чашку с агаром и давали им расти, чтобы достичь местных бактериальных концентрации, достаточные для индукции BLP локуса. Второй штамм затем инокулировали в мягком агаре расплавленного раствора, который затем наносили на предварительно заражают штаммом для проверки чувствительности. Для оценки для деятельности BLP локуса (независимо от ингибиторной активности), штаммы могут быть наложены с серией гоРи, описанные ранее штаммов репортер BlpC. Эти штаммы были построены, чтобы содержать один из трех различных аллелей blpH, которые отвечают на трех наиболее распространенных феромонов BlpC секретируемых пневмококков. Штаммы репортер имеют встроенный ген LacZ, который находится под контролем BlpH зависимого промотора и ношение удаление в гене blpC что предотвращает самостимуляция 10,11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1 Получение штамма-продуцента
- Подряд пневмококковой штамм пройти тестирование на бактериоцина производства на 5% овечьей кровью триптического соевым агаром от -80 ° C запасов морозильных.
ПРИМЕЧАНИЕ: Использование пластин крови для начального роста штамма пройти тестирование на ингибирование значительно повышает воспроизводимость анализа. Кроме того, другие не-пневмококковых штаммов, которые продуцируют бактериоцины могут быть использованы, хотя условия роста, возможно, должны быть изменены для конкретного организма. Мы использовали Streptococcus Mitis и Lactococcus Лактис в наложения Пробирной успешно. - Инкубировать в течение ночи (O / N) при 37 ° С с 5% CO 2.
- После инкубации штамма-продуцента, подготовить триптического соевый агар (TSA) пластину с помощью пипетки от 3000 до 4000 единиц каталазы на чашки, содержащие 25 мл TSA и распространять решение каталазы использованием стерильных стеклянных шариков. Пусть пластинка высохнуть в течение примерно 10 мин прибокс биологической безопасности.
- Соберите видимый количество бактерий на кончика пипетки. Stab пипетки в высушенном TSA пластины.
Примечание: более одного штамма-продуцента может быть ножом в одном TSA пластины. Важно растянуть ударов, так что в результате ореолы не перекрываются.- Если это возможно, включают известные бактериоцин производителя в качестве положительного контроля и деформации, которые будут использоваться в наложении в качестве отрицательного контроля.
ПРИМЕЧАНИЕ: Положительные и отрицательные контрольные образцы были ранее опубликованы и доступны по запросу 10.
- Если это возможно, включают известные бактериоцин производителя в качестве положительного контроля и деформации, которые будут использоваться в наложении в качестве отрицательного контроля.
- Инкубируйте TSA пластину, содержащую множество удары при 37 ° С с 5% CO 2 в течение 6 часов.
2. Создание Глицерин Запасы штамма Overlay
- Подготовьте глицерина запасы (культур, выращенных до середины экспоненциальной фазы, а затем хранили при -80 ° С после добавления глицерина) до дня наложения Пробирной. Привить 5-10 колонии пневмококковой улайн пройти тестирование на чувствительность или секреции феромонов в Тодд-Hewitt среде с экстрактом 0,5% дрожжевого (THY).
ПРИМЕЧАНИЕ: Строительство BlpC индуцибельных журналистами был описан ранее 2 и штаммы предоставляются по запросу. - Выдержите 5-10 колонии в стеклянных трубок с 5 мл твои с плотно закрытыми веками в водяной бане при 37 ° без встряхивания.
- Инкубируют культуры при 37 ° С, пока они не достигают наружный диаметр 620 от 0,3 до 0,5.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это займет около 4-5 ч в зависимости от используемого штамма.- Аккуратно переверните трубки несколько раз до измерения OD.
- Если эксперимент не может быть выполнена в тот же день или штамм будет использоваться несколько раз в будущем, сделать запасы глицерина и возобновить эксперимент на более поздний срок. Для запасов глицерина, добавить глицерин в культурах до конечной концентрации 20%. Алиготе культуры в 1,5 мл микропробирок и хранить при температуре -80 ° С. ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы могут быть сческое течение нескольких месяцев при -80 ° С. Если не делая запасы глицерина, использовать образцы непосредственно для наложения Пробирной.
3 наложения Пробирной
- Только до наложения приложение, смешивать компоненты наложения. В 15 мл коническую трубку, добавить 5 мл твой, 3000-4000 U каталазы и 200 мкл штамма наложения бульонной культуры, которая была либо выросли в тот день или глицерине культуры, что было разморозить при комнатной температуре. При использовании репортер процедить, добавить 50 мкл X-Gal (40 мг / мл), чтобы наложения смеси. Используйте одну коническую трубку за тарелку.
- Равновесие наложения смеси при комнатной температуре перед добавлением расплавленного АСП.
- Удалить TSA пластину с ножом деформации от инкубатора. Растопить твердый АСП в микроволновой печи и не держать при 55 ° С на водяной бане до начала использования. Добавить 3 мл расплавленной АСП с 1,5% агара охлаждают до 55 ° С, чтобы наложить смесь.
- Подготовьте наложения смесь непосредственно перед отбором, смесь начнет затвердевать оченьбыстро. ПРИМЕЧАНИЕ: Если накладка начинает затвердевать до обшивки, результаты будут интерпретируемы.
- Смешайте наложения смесь с помощью пипетки вверх и вниз несколько раз с 5 мл пипетки осторожно, чтобы не вводить пузырьков в смеси. Медленно пипетки наложения смесь непосредственно на зарезал TSA пластины. Держите тарелку по крышке в течение нескольких минут, позволяя агар затвердевать.
- Не поворачивайте тарелку распространять наложения смесь, это потянет рост с ножом культуры в наложение.
- Осторожно поместите TSA пластину с накладкой в 37 ° C инкубаторе, содержащем 5% CO 2 O / N (примерно 16-18 ч).
- Соблюдайте тарелки после ночного роста. Планшеты должны появиться непрозрачным от роста штамма наложения за исключением районов, где произошли ингибирование или феромон сигнализации. Они появятся как либо четких или синей зоне вокруг ножом деформации, соответственно.
ПРИМЕЧАНИЕ: Несмотря на то, измерения дментов из диаметра синего или очистки может быть определена для количественной оценки, различия в диаметре может также изменяться в зависимости от количества бактерий, которые были ножом в пластину. Наложение анализ качественный анализ, любая количественная оценка следует интерпретировать с осторожностью. Любое видимое очистки по сравнению с отрицательным контролем, рассматривается как активность.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Есть два возможных исхода в наложения Пробирной. Это должно быть возможным, чтобы увидеть рост штамма ножом после инкубации в течение ночи. В рисунке 1а, штамм наложения чувствителен к бактериоцины производится. Зона оформления могут быть визуализированы, окружающая ножом нагрузку. Кроме того, вихревое движение ножом процедите в наложения смеси можно и можно увидеть в рисунке 1а. В рисунке 1b, штамм наложения невосприимчив к бактериоцинами вырабатывается организмом как отметил отсутствие нимба, окружающего удар. Кроме того, возможно, что ножом штамм не секретирующих бактериоцины. Для анализа сигнализации, два разных результата возможны. Ножом штамм способен секретировать феромон, который взаимодействует с гистидинкиназа штамма наложения, как видно через пробоя X-гал, как показано на фиг.2А. Если феромон не активирует транскрипциюBLP локус в репортера деформации, или если ножом штамм не выделяют феромон, разбивка X-гал не произойдет, как показано на фиг.2В.
Рисунок 1. Появление BLP опосредованного ингибирования и иммунитета в наложения Пробирной. (А) Штамм P133, бактериоцин производителем, был обработан в тарелку TSA и давали расти в течение 6 часов. Штамм P250, бактериоцин отрицательное напряжение, инокулировали в наложения. Плиты были сфотографированы после O / N инкубации. Зона зазора показано стрелкой. (В) Штамм P133, был обработан в тарелку TSA и инкубировали в течение 6 часов. Штамм 130, содержащий мутацию со сдвигом рамки в blpA, инокулировали в наложения. После вывода / N инкубации планшеты были сфотографированы.
Рисунок 2 Феромоны опосредованной активации BLP локуса в анализ сигнализации. (А) Штамм P133, тип BlpC R6 секреторный, был обработан в тарелку TSA и инкубировали в течение 6 часов. Штамм P981, тип BlpC R6 репортер с делецией в BlpC, инокулировали в наложения. Фотографии были приняты после O / N инкубации. (B) P133, был обработан в тарелку TSA. После инкубации в течение 6 ч, P845, P164 BlpC типа репортер с делецией в BlpC, инокулировали в наложения. Фотографии были приняты после O / N роста.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Это наложение анализ является быстрый способ определить диапазон деятельности для производителей бактериоциновых и продемонстрировать конкурентные взаимодействия, которые могут возникнуть между пневмококковых штаммов. Наложение анализ может быть выполнен с возможностью использовать для скрининга нескольких штаммов для производства бактериоцина на одной пластине. Мы успешно скрининг больших коллекций штамма этом анализе с использованием 48-контактный репликатор для инокуляции SBA пластины из одной половины 96-луночный планшет с. После инкубации в течение ночи, рост передается TSA пластины с помощью репликатора и пирсинг поверхность агара пластины с штифты репликатора.
Другие бактериально выделяемые антимикробные пептиды, которые регулируются в плотности зависимым образом, как лантибиотиков также могут быть рассмотрены с использованием метода наложения 7,12,13. Это особенно полезно, когда очистка бактериоцина или лантибиотика трудно. Хотя надосадочные могут быть проверены на антимикробногоАктивность, выражение BLP получены бактериоцинов в бульоне очень ограничено или отсутствует (данные не показаны). Наложение анализ позволяет для роста к более высокой плотности, который не был достигнут, когда организмы растут в жидкости. Рост на твердой среде, также могут более точно отражать в естественных условий роста носоглотки.
Наложение анализ также может быть использован для изучения способности ножом деформации секретировать бактериоциновые определенный феромон сигнализации. Это требует конструкцию репортерной штамма, который экспрессирует белок рецептора феромонов и в котором феромона реагировать промотор расположенной против хода транскрипции гена LacZ. Оценка секреции феромонов на зарезал штамма является особенно полезным в качестве отсчета BLP локуса деятельности, если ножом штамм не ингибирует напряжение наложения. Неспособность ингибировать штамм наложения может быть результатом нефункционального BLP локусе (например, вштамм с мутацией транспортера), или потому, что бактериоцины, секретируемые не активен в отношении конкретного штамма наложения испытания. Репортер штамм этого сегмента выполняют дополнительную информацию о том, что локус в производителя имеет полнофункциональную двухкомпонентную систему и BlpA транспортер, позволяющий для позитивной регуляции и секреции феромона. Это означает, что любые кодируемые бактериоцины также секретируется.
Есть некоторые ограничения в этом анализе. Наложение анализ качественный анализ, так сравнения между ингибиторной активности или феромонов секреции различных штаммов должны быть сделаны тщательно. Темпы роста и условия должны быть учтены при сравнении различных штаммов, так как исход анализа в значительной мере опирается на темпы роста наложения и нанес удар штаммов. Добавление каталазы как к пластине и наложения важно для того, чтобы удалить ингибирующие эффекты пневмококковой H 2 O 2 производства наРост штамма наложения, в частности, при использовании каталазоотрицательные организм в наложении. С учетом известной разнообразие геномной содержания в пневмококковой населения, любое ингибирующей активностью видно с этого анализа не могут быть автоматически отнесены к BLP локуса без deletional анализа.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trypticase Soy Agar with 5% Sheep Blood | Fisher | B21261X | For growth from freezer cultures |
| Catalase | Sigma | C100-500mg | 4,741 Units per plate |
| Todd Hewitt Broth + Yeast Extract (THY) | Fisher | DF0492-17-6 | 30 g of THB, 5 g yeast extract, 1 L ddH2O autoclave |
| Trypticase Soy Broth + Agar plates (TSA) | Fisher | B11768 | 30 g of TS, 15 g agar, 1 L ddH2O autoclave |
| 5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside (X-gal) | Sigma | B4252-50MG | Dissolve in dimethylformamide |
| Petri dishes | Fisher | FB0875712 | |
| Spectrophometer | Measures the OD620 of cultures | ||
| 37 °C water bath | |||
| 37 °C incubator with 5% CO2 | |||
| 15 ml conical tube |
References
- Dawid, S., Roche, A. M., Weiser, J. N. The blp bacteriocins of Streptococcus pneumoniae mediate intraspecies competition both in vitro and in vivo. Infect Immun. 75 (1), 443-451 (2007).
- Sawa, N., et al. Isolation and characterization of enterocin W, a novel two-peptide lantibiotic produced by Enterococcus faecalis NKR-4-1. Appl Environ Microbiol. 78 (3), 900-903 (2012).
- Kochan, T. J., Dawid, S. The HtrA protease of Streptococcus pneumoniae controls density-dependent stimulation of the bacteriocin blp locus via disruption of pheromone secretion. J Bacteriol. 195 (7), 1561-1572 (2013).
- Lux, T., Nuhn, M., Hakenbeck, R., Reichmann, P. Diversity of bacteriocins and activity spectrum in Streptococcus pneumoniae. J Bacteriol. 189 (21), 7741-7751 (2007).
- Reichmann, P., Hakenbeck, R. Allelic variation in a peptide-inducible two-component system of Streptococcus pneumoniae. FEMS Microbiol Lett. 190 (2), 231-236 (2000).
- Saizieu, A., et al. Microarray-based identification of a novel Streptococcus pneumoniae regulon controlled by an autoinduced peptide. J Bacteriol. 182 (17), 4696-4703 (2000).
- Barbour, A., Philip, K., Muniandy, S. Enhanced production, purification, characterization and mechanism of action of salivaricin 9 lantibiotic produced by Streptococcus salivarius NU10. PLoS One. 8 (10), 77751 (2013).
- Wladyka, B., et al. Isolation, biochemical characterization, and cloning of a bacteriocin from the poultry-associated Staphylococcus aureus strain CH-91. Appl Microbiol Biotechnol. 97 (16), 7229-7239 (2013).
- Shea, E. F., et al. Bactofencin a, a new type of cationic bacteriocin with unusual immunity. 4 (6), 00498-00413 (2013).
- Son, M. R., et al. Conserved mutations in the pneumococcal bacteriocin transporter gene, blpA, result in a complex population consisting of producers and cheaters. MBio. 2 (5), (2011).
- Kochan, T. J., Dawid, S. The HtrA protease of Streptococcus pneumoniae controls density-dependent stimulation of the bacteriocin blp locus via disruption of pheromone secretion. J Bacteriol. 195, 1561-1572 (2013).
- Widdick, D. A., et al. Cloning and engineering of the cinnamycin biosynthetic gene cluster from Streptomyces cinnamoneus cinnamoneus DSM 40005. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (7), 4316-4321 (2003).
- Begley, M., Cotter, P. D., Hill, C., Ross, R. P. Identification of a novel two-peptide lantibiotic, lichenicidin, following rational genome mining for LanM proteins. Appl Environ Microbiol. 75 (17), 5451-5460 (2009).
