Introduction
Streptococcus pneumoniae, un colonizzatore comune della comunità polimicrobica del rinofaringe, è in grado di competere con altri pneumococchi e specie strettamente collegate attraverso la produzione di peptidi antimicrobici batteri prodotte (batteriocine). Ogni ceppo pneumococcica completamente sequenziato esaminato fino ad oggi contiene una versione del b acteriocin- l ike p eptide locus, BLP. Produzione batteriocina da pneumococco ha dimostrato di essere importante nel risultato sia in vitro che in vivo la concorrenza 1-4. Dinamiche competitive sono influenzati dalla espressione di diverse batteriocine insieme a proteine immunità affini in risposta ad uno specifico peptide feromone. Induzione del locus BLP è controllato da un sistema quorum sensing in cui un peptide feromone, BlpC, si lega alla chinasi sensore, BlpH, e inizia una cascata di segnalazione conseguentetrascrizione del locus 5,6 BLP. Ci sono quattro varianti alleliche di BlpC che ogni legano alla sua BlpH cognate 6. Per la cellula di sopravvivere agli effetti della propria batteriocina, i geni che codificano le proteine immunitarie affini sono trascritti sullo stesso operone come ciascuno dei geni batteriocina. Uccidere verifica se un ceppo concorrente non è in grado di up-regolare il locus BLP in risposta a feromoni esogeno o, se il ceppo manca il gene immunità specifico richiesto per la protezione. Il complesso trasportatore, BlpAB è necessario per la secrezione e la lavorazione del feromone peptidico e peptidi batteriocina 2,4. Recentemente, è stato dimostrato che una percentuale significativa di ceppi di pneumococco sono "imbroglioni", nel senso che hanno una mutazione nel gene conservato blpA che li rende incapaci di secernere feromoni e batteriocine 1,2. Questi ceppi sono in grado di rispondere alle BlpC esogeno 2 secreta da nitritoceppi noiosi consentono la produzione di proteine di immunità.
Anche se, preparazioni crude di batteriocine da surnatanti possono essere preparati da ceppi produttori utilizzando metodi biochimici passi per raggiungere la purezza, questo approccio non è utile per lo screening di grandi collezioni di isolati e se il livello di espressione batteriocina è bassa in colture in brodo cresciuta 2,7- 9. Il saggio di sovrapposizione viene usato come un modo rapido per studiare le dinamiche competitive tra i ceppi che possono esistere in vitro. Per fare ciò, un ceppo pneumococco è pre-inoculato su una piastra di agar e ha permesso di crescere fino a raggiungere concentrazioni batteriche locali sufficienti per l'induzione del locus BLP. Un secondo ceppo viene quindi inoculato in una soluzione soft agar fuso che viene poi applicato sopra il ceppo pre-inoculato per verificare la sensibilità. Per valutare l'attività del locus BLP (indipendente da attività inibitoria), i ceppi possono essere sovrapposti con una serie di three precedentemente descritti ceppi giornalista BlpC. Questi ceppi sono stati costruiti per contenere uno dei tre diversi alleli blpH che rispondono ai tre feromoni più comuni BlpC secreti dal pneumococchi. I ceppi giornalista hanno un gene lacZ integrato che è sotto il controllo di un promotore dipendente BlpH e portare una delezione nel gene blpC che impedisce auto-stimolazione 10,11.
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Protocol
1 Preparazione del Produttore Strain
- Streak un ceppo pneumococcica per essere testato per la produzione batteriocina su un sangue di pecora di soia trittico piastra di agar 5% da -80 ° C scorte congelatore.
NOTA: L'uso di piastre di sangue per la crescita iniziale del ceppo da testare per l'inibizione aumenta notevolmente la riproducibilità del dosaggio. Inoltre, altri ceppi non-pneumococco che producono batteriocine possono essere utilizzati anche se le condizioni di crescita può avere bisogno di essere modificato per un organismo specifico. Abbiamo usato Streptococcus mitis e Lactococcus lactis nel saggio overlay con successo. - Incubare la piastra overnight (O / N) a 37 ° C con 5% di CO 2.
- Dopo l'incubazione del ceppo produttore, preparare il piatto trittico di agar soia (TSA) pipettando 3.000 a 4.000 unità di catalasi su piastre contenenti 25 ml di TSA e diffondere la soluzione catalasi utilizzando microsfere di vetro sterili. Lasciate asciugare la piastra per circa 10 minuti sottouna cappa di sicurezza biologica.
- Raccogliere una quantità visibile di batteri su una punta della pipetta. Pugnalare la punta della pipetta nella piastra TSA secca.
NOTA: Più di un ceppo produttore può essere accoltellato in un unico piatto TSA. È importante distanziare i colpi in modo che aloni risultanti non si sovrappongano.- Se possibile, includere noto batteriocine produttore come controllo positivo e il ceppo da utilizzare nella sovrapposizione come controllo negativo.
NOTA: I controlli positivi e negativi sono stati precedentemente pubblicati e sono disponibili su richiesta 10.
- Se possibile, includere noto batteriocine produttore come controllo positivo e il ceppo da utilizzare nella sovrapposizione come controllo negativo.
- Incubare la piastra TSA contenente più pugnalate a 37 ° C con il 5% di CO 2 per 6 ore.
2. Fare scorte glicerolo del ceppo Overlay
- Preparare le scorte glicerolo (colture cresciute a fase mid-esponenziale e poi conservati a -80 ° C previa aggiunta di glicerolo) prima del giorno del test di sovrapposizione. Inoculare 5-10 colonie di str pneumococcoain per essere testato per la sensibilità o la secrezione di feromoni in Todd-Hewitt media con estratto di 0,5% di lievito (THY).
NOTA: Costruzione di giornalisti inducibili BlpC è stato precedentemente descritto e 2 ceppi sono disponibili su richiesta. - Incubare 5-10 colonie in tubi di vetro con 5 ml di THY con coperchi ben chiusi in un bagno d'acqua a 37 ° senza agitare.
- Incubare colture a 37 ° C fino a raggiungere un diametro esterno 620 di 0,3 a 0,5.
NOTA: Questo richiederà circa 4-5 ore a seconda del ceppo utilizzato.- Capovolgere delicatamente la provetta un paio di volte prima di misurare il diametro esterno.
- Se l'esperimento non può essere effettuata il giorno stesso o il ceppo sarà utilizzato più volte in futuro, fare scorte di glicerolo e di riprendere l'esperimento in una data successiva. Per gli stock di glicerolo, aggiungere glicerolo alle culture ad una concentrazione finale del 20%. Culture aliquote in provette da 1,5 ml microcentrifuga e conservare a -80 ° C. NOTA: I campioni possono essere ssbranati da mesi a -80 ° C. Se non fare scorte di glicerolo, utilizzare direttamente i campioni per l'analisi di sovrapposizione.
3. Overlay saggio
- Poco prima di sovrapporre l'applicazione, miscelare i componenti di sovrapposizione. In un tubo da 15 ml, aggiungere 5 ml di THY, 3000-4000 U di catalasi, e 200 ml di brodo di coltura ceppo di sovrapposizione che è stato sia cresciuto quel giorno o uno stock di glicerolo della cultura che è stato scongelato a temperatura ambiente. Se si utilizza il ceppo giornalista, aggiungere 50 ml di X-gal (40 mg / ml) alla miscela di sovrapposizione. Utilizzare un tubo conico per piastra.
- Equilibrare miscela sovrapposizione a temperatura ambiente prima aggiunta di liquido TSA.
- Rimuovere la piastra TSA con ceppo accoltellato da incubatrice. Sciogliere solido TSA in forno a microonde e mantenerlo a 55 ° C bagnomaria fino al momento dell'uso. Aggiungere 3 ml di liquido TSA con il 1,5% agar raffreddata a 55 ° C per sovrapporre miscela.
- Preparare immediatamente la miscela di sovrapposizione prima pipettaggio, il composto inizierà a solidificarsi moltorapidamente. NOTA: Se la sovrapposizione inizia a solidificarsi prima di placcatura, i risultati saranno interpretabile.
- Mescolare il composto overlay pipettando su e giù parecchie volte con una pipetta 5 ml facendo attenzione a non introdurre bolle nella miscela. Lentamente pipettare miscela overlay direttamente alla piastra TSA accoltellato. Conservare la piastra sul banco per qualche minuto per consentire l'agar per indurire.
- Non ruotare la piastra per distribuire la miscela overlay, questo tirerà crescita della cultura accoltellato nella sovrapposizione.
- Posizionare con cura piastra TSA con sovrapposizione in 37 ° C incubatore contenente il 5% di CO 2 O / N (circa 16-18 ore).
- Osservare le piastre dopo la crescita durante la notte. Le piastre devono apparire opaca dalla crescita del ceppo sovrapposizione, tranne nelle zone in cui si è verificato l'inibizione o feromone segnalazione. Questi appariranno come zone sia chiaro o blu attorno al ceppo accoltellato, rispettivamente.
NOTA: Anche se measurements del diametro di compensazione blu o possono essere determinati per la valutazione quantitativa, differenze di diametro possono anche variare a seconda della quantità di batteri che è stato accoltellato nella piastra. Il saggio overlay è un test qualitativo, ogni valutazione quantitativa devono essere interpretati con cautela. Qualsiasi compensazione visibile rispetto al controllo negativo è considerata attività.
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Representative Results
Ci sono due possibili risultati nel test di sovrapposizione. Dovrebbe essere possibile vedere la crescita del ceppo accoltellato dopo incubazione durante la notte. Nella Figura 1A, il ceppo sovrapposizione è sensibile alle batteriocine prodotte. Una zona libera può essere visualizzata circonda il ceppo accoltellato. Inoltre, vorticoso del ceppo pugnalato nella miscela sovrapposizione è possibile e può essere visto in Figura 1A. Nella Figura 1B, il ceppo overlay è immune alle batteriocine essere secrete come notato da un'assenza di un alone che circonda la pugnalata. È anche possibile che il ceppo accoltellato non sta secernendo batteriocine. Per il saggio di segnalazione, due esiti diversi sono possibili. Il ceppo accoltellato è in grado di secernere feromoni che interagisce con l'istidina chinasi del ceppo sovrapposizione, come visto attraverso la ripartizione di X-gal, come mostrato nella Figura 2A. Se il feromone non attiva la trascrizione dellocus BLP nel ceppo giornalista, o se il ceppo accoltellato non secernono feromoni, ripartizione di X-gal non si verificano come mostrato in Figura 2B.
Figura 1 Aspetto di BLP mediata inibizione e l'immunità in un saggio overlay. (A) Strain P133, un produttore batteriocina è stata aggiunta in una piastra TSA e permesso di crescere per 6 ore. Strain P250, un ceppo batteriocina negativo, è stato inoculato in sovrapposizione. Le piastre sono state fotografate dopo O / N di incubazione. Una zona libera è indicato dalla freccia. (B) Strain P133 è stata aggiunta in una piastra TSA e incubato per 6 ore. Strain 130, contenente una mutazione frameshift in blpA, è stato inoculato in sovrapposizione. Dopo O / N di incubazione, le piastre sono state fotografate.
Figura 2 feromone mediata attivazione di locus BLP nel segnalare dosaggio. (A) Strain P133, un tipo BlpC R6 secretore, è stata aggiunta in un piatto TSA e incubato per 6 ore. Strain P981, un tipo BlpC R6 giornalista con una delezione in BlpC, è stato inoculato in sovrapposizione. Le fotografie sono state scattate dopo O / N di incubazione. (B) P133 è stata aggiunta in una piastra TSA. Dopo incubazione per 6 ore, P845, un BlpC tipo P164 giornalista con una delezione in BlpC, è stato inoculato in sovrapposizione. Le fotografie sono state scattate dopo O / N crescita.
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Discussion
Questo saggio overlay è un modo rapido per determinare la gamma di attività per i produttori batteriocina e dimostrare interazioni competitive che possono verificarsi tra i ceppi di pneumococco. Il dosaggio può essere adattato overlay da utilizzare per lo screening più ceppi per la produzione batteriocine una singola piastra. Abbiamo proiettato con successo grandi collezioni di deformazione con questo dosaggio utilizzando un replicatore 48-pin per inoculare le piastre SBA da una metà di una piastra a 96 pozzetti. Dopo incubazione durante la notte, la crescita viene trasferito alla piastra TSA con il replicatore e piercing la superficie agar della piastra con i perni del replicatore.
Altri peptidi antimicrobici batteri secrete che sono regolati in maniera dipendente dalla densità come lantibiotics possono anche essere esaminate con la tecnica di sovrapposizione 7,12,13. Ciò è particolarmente utile quando la purificazione di un batteriocina o lantibiotic è difficile. Anche se surnatanti possono essere testati per antimicrobicaattività, espressione delle BLP derivato batteriocine in brodo è molto limitata o inesistente (dati non mostrati). Il test overlay consente la crescita di una maggiore densità che non si ottiene quando gli organismi sono coltivate in liquido. La crescita su un terreno solido potrebbe anche riflettere più da vicino le condizioni di crescita in vivo del rinofaringe.
Il dosaggio sovrapposizione può anche essere utilizzato per esaminare la capacità del ceppo accoltellato a secernere il feromone segnalazione specifica batteriocine. Ciò richiede la costruzione di un ceppo giornalista che esprime la proteina recettore feromone e in cui un feromone promotore, è posto a monte del gene lacZ. Apprezzamento della secrezione di feromoni da un ceppo accoltellato è particolarmente utile come una lettura di attività locus BLP se il ceppo accoltellato non inibisce il ceppo overlay. L'incapacità di inibire il ceppo sovrapposizione potrebbe essere il risultato di un locus BLP non funzionale (ad esempio in unceppo con una mutazione trasportatore), o perché le batteriocine secreti non sono attivi contro il ceppo particolare sovrapposizione testato. La sovrapposizione ceppo giornalista fornisce informazioni aggiuntive che il locus nel produttore ha un trasportatore a due sistema di componenti pienamente funzionale e BlpA consentendo sovraregolazione e la secrezione del feromone. Ciò implica che qualsiasi batteriocine codificati sono anche secreti.
Ci sono alcune limitazioni a questo test. Il saggio overlay è un test qualitativo, così il confronto tra l'attività di inibizione o la secrezione di feromoni di ceppi diversi devono essere fatte con attenzione. Prezzi e condizioni di crescita devono essere considerati quando si confrontano diversi ceppi perché il risultato del test si basa fortemente sul tasso di crescita della sovrapposizione e ceppi accoltellato. L'aggiunta di catalasi sia alla piastra e la sovrapposizione è importante al fine di eliminare gli effetti inibitori di pneumococco H 2 O 2 produzione sulla crescita del ceppo sovrapposizione, in particolare quando si utilizza catalasi organismo negativo nella sovrapposizione. Data la diversità nota di contenuto genomica nella popolazione pneumococco, qualsiasi attività inibitoria visto con questo dosaggio non può essere attribuito automaticamente al locus BLP senza l'analisi verso le cancellazioni.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trypticase Soy Agar with 5% Sheep Blood | Fisher | B21261X | For growth from freezer cultures |
| Catalase | Sigma | C100-500mg | 4,741 Units per plate |
| Todd Hewitt Broth + Yeast Extract (THY) | Fisher | DF0492-17-6 | 30 g of THB, 5 g yeast extract, 1 L ddH2O autoclave |
| Trypticase Soy Broth + Agar plates (TSA) | Fisher | B11768 | 30 g of TS, 15 g agar, 1 L ddH2O autoclave |
| 5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside (X-gal) | Sigma | B4252-50MG | Dissolve in dimethylformamide |
| Petri dishes | Fisher | FB0875712 | |
| Spectrophometer | Measures the OD620 of cultures | ||
| 37 °C water bath | |||
| 37 °C incubator with 5% CO2 | |||
| 15 ml conical tube |
References
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